mRNA差异显示技术在肿瘤研究中的应用

　　mRNA差异显示技术（mRNA differential display）是一种快速而有效的克隆差异性表达基因的方法。1992年Liang 和Pardee［1］首次应用差异显示技术对比人类乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞所表达的mRNA，以此来克隆癌细胞所特有的基因。差异显示技术为寻找新基因开辟了捷径，是该领域的重大突破,已应用于各个领域，如农业、植物、动物、医学；就医学而言，涉及了胚胎发育器官形成、遗传性疾病、药物作用原理、基因治疗和免疫反应等研究领域，特别是在人类与肿瘤的战斗中有着极为广泛的用途。

　　差异显示的理论基础是基因的选择性表达。哺乳动物基因组约含100000个不同的基因，对于某一细胞而言，仅一小部分（约15%）表达。在正常细胞的生长分化过程中，基因的选择性表达决定着生命的进程；在病理过程中，作为疾病的原因或结果，也存在着表达的基因异常。因此克隆这些差异表达的基因是当前生物医学领域的研究热点，该领域的不断深入将为从分子水平了解疾病的发生和发展规律奠定基础，并为临床合理的治疗提供依据。

　　差异显示的关键在于选择具有高度可比性，表型特性差异显著的对比对象。可比性即严格控制遗传背景，摒除无关差异，仅使所关注的表型（如肿瘤细胞的转移潜能）具有显著差异。差异显示从表型差异入手，通过展示mRNA的差异深入到基因差异，克隆与表型差异高度相关的新基因。

　　就技术而言，差异显示巧妙地结合了两个基本的分子生物技术：逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及电泳。经过不断的改良，差异显示已成为标准化的cDNA克隆方法，有多个公司的试剂盒及设备使研究者可在短时间内启动差异显示，几天内获得结果。较其他克隆新基因的方法而言，差异显示具有简便易行的优势，因此在基础和临床研究中有着推广和普及的可能性。

　　一、技术路线

　　差异显示技术实质是RT-PCR,其独特之处在于2种PCR引物的设计:锚定引物T12MN,含12个T可以结合于mRNA3'端poly(A)，M为AGC 3种碱基之一，N为AGCT之一，如T12CA可结合于在poly(A)上游为GT的mRNA；随机引物可以在与poly(A)末端不同距离的多个位置上结合，因此差异显示的产物是不同长度的cDNA片段混合物。通过随机引物和锚定引物的多种组合,差异显示有展示约10 000至15 000种mRNA的潜力，在DNA测序胶上对比细胞或组织中所表达的mRNA，从而寻找在不同细胞，不同发育和分化阶段，不同部位差异表达的基因。目前引物的设计更为新颖有效，如GenHunter公司在引物末端加入HindIII酶切位点，便于克隆；Genomyx公司则在锚定引物5′末端加入T7RNA多聚酶启动子,在随机引物3′末端加入M13引物序列,便于直接合成反义RNA探针及直接的双相测序。随引物的延长,退火温度可由40℃提高到46℃,提高了差异显示的重复性。另外可针对某一基因家族(如Ser/Thr激酶［2］,锌指蛋白家族［3］)设计引物,使所获得的差异基因相对集中。

　　其技术路线为：首先提取高质量的总RNA,DNA酶处理后利用锚定引物T12MN逆转录,其后应用相同的T12MN及随机引物进行PCR扩增；同时掺入同位素来标记产物。产物用测序胶电泳分离，放射自显影。将差异条带切下，用相同的引物进行2次PCR扩增。产物经标记制成探针，通过Northern杂交来验证其在不同样本中的表达差异，去除假阳性(RNase保护实验由于杂交发生在小体积中有利于复性，可用来替代Northern杂交，特别是对于低转录水平的mRNA更为用效，可以探测到单个细胞中1～5个拷贝数的mRNA)。被证实的cDNA片段可克隆到T/A载体中进行测序，其序列与Genbank数据库进行同源性检验，便可确定是已知基因或者是与已知基因无显著同源性的未知基因。目前已有多种非放射性标记方法,如溴化乙锭染色的琼脂糖电泳［4］(简便,但灵敏度低)、银染［5］(快速,灵敏度高,便于切条带)、荧光［6］(应用荧光成象系统,自动, 灵敏度高,应用广泛)及化学发光［7］。

　　二、差异显示的优越性

　　1.差异显示仅需少量的总RNA（0.2～0.02 μg,约相当于从200个细胞中所提取的总RNA）。这使得材料来源困难的研究成为可能，如细针穿刺细胞学标本，内窥镜活检标本等。用总RNA和poly(A)RNA做模板可获得相同结果，这也说明在大量的tRNA，rRNA存在的情况下，锚定引物T12MN能特异的结合于mRNApoly(A)的尾部。

　　2.差异显示应用PCR技术，起到了放大作用，敏感度高。为了筛选低转录水平的mRNA已进行了许多改良，如Hakvoort等［8］将消减杂交与差异显示结合，先通过杂交使差异片段富集，再进行并列比较，则低转录水平的mRNA得到展示的可能性大大提高。又如Ralph等［9］通过2轮PCR扩增（巢式），第2轮引物较第1轮在3′端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，模板间的竞争减少,因此低转录水平的mRNA易于被扩增。

　　3.差异显示在测序胶上同时并列比较2个或多个研究对象，比如转移潜能高、中、低的癌细胞系，使后期在选择差异片段时有所参考。同时回收那些出现或消失的差异条带，则可获得“打开”或“关闭”的基因，比如同时克隆激活的癌基因和失活的抑癌基因。

　　4.差异显示可以在2～3周时间内获得结果。最大程度的排除假阳性依赖于三个层次：第一、不同浓度模板的平行反应，及重复实验用于排除由于模板质量数量而导致的假阳性。第二、严格地对照实验，如用缺省逆转录酶或用RNase降解RNA做为阴性对照来排除DNA污染。第三、差异片段的初筛，如将研究对象RNA逆转录,掺入同位素制成探针，分别与点有所有差异片段的尼龙膜杂交(即反向点杂交)［10］，只有那些“此有彼无”的片段进入下一阶段研究，该法有效的集中了目标，削减了繁重的后续工作。

　　三、差异显示在肿瘤研究中的应用

　　肿瘤发生是多步骤的过程，涉及到原癌基因的激活及抑癌基因的失活而导致的细胞失控性生长。在此综述差异显示在肿瘤研究中最多见的4种模式以备参考，可见巧妙地匹配研究对象使差异显示成为克隆肿瘤相关基因、转移相关基因的有力工具。

　　1.差异显示技术用于对比恶性肿瘤组织及其邻近的正常组织：近年有很多将差异显示技术应用于临床手术标本的报道，对比对象涉及脑肿瘤、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌组织及与其对应的正常组织，试图克隆与癌发生相关的基因。Meyer-Siegler和Hudson［11］将差异显示用于前列腺癌淋巴结转移灶与正常前列腺组织的对比研究，获得166 bp的cDNA片段在转移灶高表达，与人类巨噬细胞移动抑制因子（MIF）93%同源，并在临床已转移的前列腺癌手术标本中得到证实。高表达的MIF将有可能成为转移性前列腺癌的诊断标志物。对于临床工作者来说，差异显示技术无疑有着标本来源丰富的优势，使临床研究深入到基因水平。但必须意识到慎重选择对比对象的重要性,以确保二者具有高度可比性。如果能找到在临床指标如治疗反应、复发率、转移率、生存率等方面高度可比的模型，则所克隆基因有可能成为新的诊断及预后的分子标志物。

　　2.差异显示用于肿瘤细胞系的研究：肿瘤基础研究中已建立了许多肿瘤细胞系及亚系，具有遗传背景一致、表型差异单纯的优势，是差异显示良好的模型。为了研究肿瘤转移相关基因，Lim等［12］以鼠结肠腺癌细胞系的3个具有不同转移潜能亚系作为差异显示的对象。当接种于裸鼠时，NL4亚系无转移能力，而NL17亚系（i.v.）和NL22亚系(s.c.)在肺部形成巨大转移灶。各细胞系转移表型的差异反映了其基因水平的差异。差异显示获得新基因HMC在高转移亚系NL17及NL22中高表达，在低转移亚系NL4中极低表达。Northern杂交证明在13例结肠癌病人中7例的原发癌灶及转移灶HMC表达较正常粘膜高，最高可达38倍。HMC与有丝分裂调控蛋白家族有部分同源性，为其功能研究提供了线索。为了探讨乳腺癌演进过程中表达基因的变化，研究者以乳腺癌细胞系MCF-7及MCF-7ADR作为研究对象［13］。这两个细胞系是乳腺癌演进的模型：MCF-7代表乳腺癌早期，雌激素依赖，雌激素受体阳性，三苯氧胺治疗有效，波形蛋白阴性，对阿霉素敏感，体外matrigel侵袭试验及裸鼠体内试验均不侵袭转移；相反MCF-7ADR代表进展期乳腺癌，不依赖雌激素，雌激素受体阴性，三苯氧胺治疗无效，波形蛋白阳性，对阿霉素不敏感，表现出体内外侵袭转移能力。差异显示获得了一个新基因PAP在MCF-7ADR中高表达，其在进展期乳腺癌细胞系MCF-7ADR中的作用尚待研究。

　　3.差异显示用于转染细胞的研究：细胞转染技术在肿瘤研究中正被广泛应用，差异显示对比转染前后,可用来研究所转染基因的下游基因及作用途径。将最早被克隆的癌基因ras及突变率最高的抑癌基因p53（温度敏感型）共转染鼠胚胎纤维母细胞(REF)得到亚系A1-5,在非许可温度培养时p53为突变型，在许可温度培养时p53为野生型［14］。提取各细胞系mRNA并列比较，获得新基因mob-1，不论p53蛋白是突变型还是野生型，mob-1在共转染后均高表达，可见其高表达由ras所诱导而与p53无关。mob-1编码产物为分泌性多肽，与前炎症细胞因子家族成员IP-10同源，其意义在于将慢性炎症反应，ras的活化及癌变联系起来，并有可能成为ras发生突变的分泌型分子标志物。研究者通过微细胞介导将正常的人类6号染色体转入人类黑色素瘤细胞系Me1JuSo及其高转移亚系C1861，虽然不影响其成瘤率，但抑制其转移率至少95%，提示位于6号染色体上的基因可能调控着基因组中转移抑制基因的表达，差异显示使在基因水平探讨此显著的转移抑制作用成为可能［15］。结果发现转染后激活新基因Kiss-1。将Kiss-1转染人类黑色素瘤细胞系Me1JuSo及其高转移亚系C1861并稳定表达后，接种裸鼠体内无1例发生转移。可见差异显示使研究者从表面现象的研究迅速深入到基因水平。

　　4.差异显示用于外源性因素作用机制的研究：人为的给予或去除某种外源性因素（如药物，激素，化学物质，紫外线）作用一段时间后，差异显示对比处理前后mRNA，在基因水平揭示外源性因素的作用机制。三苯氧胺（tamoxifen）对人类乳腺癌细胞增生具有显著抑制作用，20年来被用于临床治疗乳腺癌病人。为了探讨其药理作用，有研究者提取正常乳腺及人类乳腺癌组织在三苯氧胺治疗前，治疗中的mRNA进行对比［16］，分离到一个202 bp的cDNA(AP5-1)在正常及治疗前表达，而治疗后缺失。AP5-1与CD36基因有99%同源性，而后者为细胞外基质蛋白凝血酶敏感蛋白(thrombospondin-1)的受体。已知其参与肿瘤细胞的血行转移、浸润及血管形成。可见三苯氧胺通过使其受体下调而发挥抗肿瘤作用。宫颈细胞的癌变是多因素多步骤的过程。HPV感染是主要原因，但病毒感染者癌变的长潜伏期及少于50%的癌变率说明癌变需要其他因素共同作用，如吸烟［17］。人正常宫颈细胞(HEN)在HPV16感染后成为永生的细胞系(HEN-16)，接种裸鼠皮下不成瘤。HEN-16培养时加入香烟冷凝物作用一段时间后，接种裸鼠皮下成瘤，由此来源的细胞系称HEN-16-2。上述3个细胞系代表了宫颈癌变的两个因素，三个阶段。差异显示比较了3个细胞系的mRNA后获得新基因PA4在永生细胞HEN-16及转化细胞HEN-16-2中高表达，表达水平是正常细胞的2～3倍，而另一新基因PA9仅在正常宫颈细胞中表达。差异显示清楚的再现了HPV感染，吸烟使癌基因PA4活化，抑癌基因PA9失活而导致宫颈癌变的过程。

　　综上所述，差异显示技术简便易行，广泛应用于各个领域。选择各自研究领域所特有的，巧妙匹配的研究对象，应用成熟的差异显示技术，可在短时间内克隆新基因，在基因水平探讨各种生理及病理过程。

　　 作者单位：100083　北京医科大学病理学系

　　参考文献

　　1　Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992, 257：967-971.

　　2　McClelland M, Ralph D, Cheng R, et al. Interactions among regulators of RNA abundance characterized using RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR. Nucleic Acids Res, 1994, 22：4419-4431.

　　3　Stone B, Wharton W. Targeted RNA fingerprinting： the cloning of differentially-expressed cDNA fragments enriched for members of the zinc finger gene family. Nucleic Acids Res, 1994, 22：2612-2618.

　　4　Sokolov BP, Prockop DJ. A rapid and simple PCR-based method for isolation of cDNA from differentially expressed genes. Nucleic Acids Res, 1994, 22：4009-4015.

　　5　Lohmann J, Schickle H, Bosch TC. REN display, a rapid and efficient method for nonradioactive differential display and mRNA isolation.Biotechniques, 1995,18：200-202.

　　6　Ito T, Kito K, Adati N, et al. Fluorescent differential display： Arbitrarly primed RT-PCR fingerprinting on an automated DNA sequencer. FEBS Lett,1994,351：231-236.

　　7　An G, Luo G, Veltri RW. Sensitive, nonradioactive differential display method using chemiluminescent detection. Biotechniques,1996,20：342-344.

　　8　Hakvoort TB, Leegwater AC, Michiels FA, et al. Identification of enriched sequences from a cDNA subtraction-hybridization procedure.Nucleic Acids Res, 1994, 22：878-879.

　　9　Ralph D, McClelland M, Welsh J. RNA fingerprinting using arbitrarily primed PCR identifies differantially regulated RNAs in mink lung (My1Lu) cells growth arrested by transforming growth factor betal. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90：10710-10714.

　　10　Mou L, Miller H, Li J, et al. Improvements to the differential display method for gene analysis. Biochem Biophys Res Comm, 1994,199：564-569.

　　11　Meyer-Siegler K, Hudson PB. Enhanced expression of macrophage migration inhibitory factor in prostatic adenocarcinoma metastases. Urology,1996, 48：448-452.

　　12　Lim J, Kuroki T, Ozaki K, et al. Isolation of murine and human homologues of the fission-yeast dis3+ gene encoding a mitotic-control protein and its overexpression in cancer cells with progressive phenotype. Cancer Res, 1997, 57：921-925.

　　13　Schiemann S, Ruckels M, Engelholm LH, et al. Differential gene expression in human mammary carcinoma cells： identification of a new member of a receptor family. Anticancer Res, 1997, 17：13-20.

　　14　Liang P, Averboukh L, Zhu W, et al. Ras activation of genes: Mob-1as a model. Proc Natl Acad Sci USA,1994, 91：12515-12519.

　　15　Lee JH, Welch DR. Identification of highly expressed genes in metastasis suppressed chromosome 6/human malignant melanoma hybrid cells using subtractive hybridization and differential display. Int J Cancer, 1997, 71：1035-1044.

　　16　Silva ID, Salicioni AM, Russo IH, et al. Tamoxifen down-regulates CD36 messenger RNA levels in normal and neoplastic human breast tissues. Cancer Res, 1997, 57： 378-381.

　　17　Yang X, Nakao Y, Pater MM, et al. Identification of two novel cellular genes associated with multistage carcinogenesis of human endocervical cells by mRNA differential display. Carcinogenesis, 1996,17：563-567.