肝血窦内皮细胞研究进展

　　摘要 本文主要综述了90年以来有关肝血窦内皮细胞（HSEC）研究的新进展，包括HSEC的分离培养，细胞窗孔及其有关调节因素，第Ⅷ因子相关抗原的表达变化与肝纤维化的关系，分泌一氧化氮（NO）和内皮素（ET）及其对肝微循环调节和病理生理意义，细胞表面多种受体和粘附分子的表达与功能作用及其与肿瘤转移的相关性等。

　　肝血窦内皮细胞（Hepatic Sinusoidal Endothelial cell,HSCE）是肝非实质细胞中数量最大的一种细胞，约占肝非实质细胞总数的50%。它的形成结构和功能特性与一般血管内皮细胞均有很大差异。一般血管内皮细胞的研究较早也较广泛而深入，HSEC的研究则起步较晚，近年随着HSEC分离培养方法的不断完善，对HSEC的研究也逐渐增多和深入，发现HSEC在肝功能活动中发挥重要作用[1]，本文就HSEC的近年研究进展作一综述。

　　1 HSEC的分离培养

　　内皮细胞尤其是实质性器官内血管内皮细胞的研究多需依赖体外实验方法。Knook首次用链霉蛋白酶（pronase）灌注肝组织，以离心淘洗术（centrifugal elutriation）分离纯化HSEC，但链霉蛋白酶可破坏HSEC的表面受体，影响细胞质量。以后用肠毒素取代链霉蛋白酶，肠毒素只破坏肝细胞，不破坏HSEC表面受体。但市场上缺乏商品化肠毒素，淘洗术设备昂贵、操作程序复杂，难推广应用。应用胶原酶灌注肝，继而用二氧化硅（percoll）密度离心法分离HSEC，既能使肝细胞很快完全分解，又能完好的保存HSEC活性和内吞能力。Percoll在相对高密度情况下，粘度较低，也不影响细胞表面结构。分离获得的HSEC中可能混有少量Kupffer细胞，可通过短期培养使其中的Kupffer细胞快速贴壁，即可获得高纯度（90%以上）的HSEC。本实验室研究体会[2，3]，Ⅳ型胶原酶溶液中含5mMCa2+并在390pH7.5条件下，酶活力最佳。胶原酶消化不足，可影响细胞得率；消化时间过长，则细胞膜破损，尤其是大量肝细胞被破坏，DNA外释，使残存的细胞相互粘连，影响细胞得率和细胞活力。在胶原酶溶液中加入少量DNase,可防止细胞间的粘连。在灌注胶原酶时，压力应控制在每分钟10ml以内，否则HSEC窗孔结构易受损害。另外，在缓冲液内入鞣酸，可防止HSEC众多窗口出现腔隙而相互融合。HSEC培养在胶原或纤维整合素支持膜上，细胞窗减少，也不形成三维空间结构：但在层粘连蛋白凝胶膜上可形成与血窦类似的三维管样结构，但内皮窗孔数减少[4]。如在Matrigel凝胶膜（其中含高浓度层粘链蛋白、Ⅳ型胶原、成纤维细胞生长因子、移动因子等）上培养HSEC，不但能促进细胞形成三维管状结构，还能保持窗孔数目。故Matrigel是体外研究HSEC的结构和功能的较理想的培养基。

　　2 HESC的窗孔及其变化调节

　　HESC有发达的窗孔，大多聚集形成筛板状，内皮外常无基膜。HESC窗孔是狄斯间隙内外进行物质交换的重要通道，是维持肝细胞微环境稳定的重要结构。电镜下观察大鼠HSEC，肝小叶中央带HSEC的窗孔直径为150nm，不叶周边带为175nm。窗孔大小可随肝生理病理状况的变化而改变，许多药物或制剂如细胞松弛素B、二甲基亚硝胺、硫代乙酰胺、双泛酰胺乙胺、细胞外基质、5-羟色胺等，均能改变窗孔直径，从而影响其物质转运动能[5、8]。肌丝抑制剂细胞松弛素B能使内皮窗孔直径增大，表明窗孔的变化与细胞骨架有关。微丝环绕在窗孔周围，相信窗孔间由16nm的中间丝连接；筛板周围又环着微管，筛板之间也有微管形成的网架结构。细胞骨架变化可动态调节窗孔的大小变化。[9，10]用免疫荧光和荧光染色双标法显示的HSEC，我们也发现胞质内有发达的微丝微管并构成窗孔的支架[1]。HSEC如同肌纤维一样也有质膜钙通道，也有钙一钙调蛋白-肌动肌球蛋白系统，胞质内钙浓度的变化可激活该系统，肌丝发生滑动，进而改变窗孔的大小[12]。用5-羟色胺处理培养的HSEC，它是钙通道激活剂，可和钙通道阻滞剂结合，使钙及非特异离子通道打开，Ca2+内流并与在胞质内的钙调蛋白结合，激活肌球蛋白轻链使之磷酸化，进一步激活肌动蛋白ATP酶，肌动蛋白收缩，窗口收缩20%。我们的研究也发现5-羟色胺可使HSEC内钙含量增高，细胞骨架发生变化，窗孔相应缩小；若先用钙通道阻滞剂异搏定处理HSEC，5-羟色胺则不能影响窗孔变化[1]。新近发现，若HSEC表达细小白蛋白（parvalbumin），即可阻止窗孔缩小，进而使窗孔扩大[13]。细小白蛋白属于钙结合蛋白家族，仅出现在哺乳动物某些肌纤维内，它与Ca2+有高度亲合力，与钙调蛋白竞争自由Ca2+，故可阻止肌浆内的Ca2+高峰，影响肌丝活动。我们用细胞松弛素B作用于培养的HSEC，发现细胞内的Ca2+含量变化不明显或呈下降趋势而窗孔则明显扩大[11]。细胞松驰素B可覆盖于肌动蛋白的末端，阻止其快速延长，使细胞内肌动蛋白聚合受阻，导致窗孔扩大。Latrunculin a的生物学效应与细胞松驰素B相同，但前者的最低用量是后者的1/100，且比后者早半小时达到最大效果[14]。这主要因为二者的作用机理不同，Latrunculin a是一种能和肌动蛋白单体结合形成1：1的混合物，从而降低肌动蛋白的分布密度。由此可见，HSEC窗孔结构调节受细胞内Ca2+浓度的影响，同时肌动蛋白的分布和状态对窗孔的变化也起重要作用，甚至起关键作用。

　　HSEC窗孔也是一种动态的生物滤过器，可阻挡直径大小200-500nμ的乳糜微粒，直径较小的乳糜微粒降解物则可通过。若用药物等因素使HSEC窗孔变小或消失，富含胆固醇的乳糜微粒降解物不能进入狄氏隙被肝细胞摄取，以至肝细胞合成胆固醇的负调节的作用减弱，内源性胆固醇合成增多，血液中的LDL和甘油三脂增多，易致动脉粥样硬化。另外，窗孔变化也影响肝细胞摄取外源性脂质和维生素A，贮脂细胞内的维生素A减少易转化为成纤维细胞，基膜和胶原生成增多，有可能导致肝纤维增生[15]。

　　3 HSEC的第Ⅷ因子相关抗原的表达

　　第Ⅷ因子相关抗原也称Von Willebrand factor(vWF)，是由血管内皮细胞和巨核细胞合成的一种大分子糖蛋白，在损伤后的止血过程中起重要作用。体内存在三种不同形式的vWF，即血浆内可溶性vWF，内皮细胞和血小板胞质颗粒内的vWF及基膜上的vWF。基膜上的vWF，即血浆内可溶性vWF，内皮细胞和血小板胞质颗粒内的vWF及基膜上的vWF。基膜上的vWF是血小板粘附于内皮下层的量主要活性物质，在血小板聚集附着于破损血管壁上起重要作用。一般血管内皮细胞表达vWF，它贮存在胞质内的一种杆状细胞器（W-P小体）内。是内皮细胞的特异性标志。HSEC是否表达vWF，曾有不同的研究报道，近年研究新分离的HSEC中不足5%的细胞呈vWF免疫荧光阳性，培养2-4天后的细胞vWF免疫荧光反应显著增强；HSEC和其培养液内蛋白质提取及SDS-DAGE分析，均证明其中含有vWF阳性产物，mRNA的提取和印迹杂交分析结果也证明HSEC内含有vWF的基因转录产物，而Kupffer细胞、贮脂细胞、肝细胞等均呈vWF阴性。已证明HSEC内含的vWF有三种蛋白质结构：vWF前体，成熟的vWF和降解的小分子vWF多肽。故可认为，正常肝可能仅少量HSEC表达vWF，故还不能将vWF的表达与否作为断断HSEC的标志。我们实验室和其他的学者的研究均发现[2，6]，肝纤维化病变中的HSEC不仅在结构上出现血管化现象（窗孔减少甚至消失），而且大量细胞由vWF阴性转为阳性，其病理意义有待探讨。

　　4 HSEC分泌一氧化氮和内皮素及其对肝微循环的调节作用

　　肝血窦的血流量很大，其血流变化对门脉压力的形成有一定的影响。肝血窦内的血流变化与狄氏隙内的贮脂细胞（又称星状细胞或Ito细胞）相关[17]。肝贮脂细胞也是一种肌成纤维细胞，它主要受HSEC分泌的一氧化氮（NO）和内皮素（ET）的作用而发生变化。ET是一种强有力的血管活性物质（21个氨基酸多肽），有ET-1、ET-2和ET-3三种同工型。ET主要由内皮细胞产生，通过旁泌作用于邻近的细胞和平滑肌细胞、周细胞和肝贮脂细胞，也可能自泌作用于自身，ET的主要功能是调控局部血管张力，但有人认为ET对生长和发育也有广泛的影响[19]。ET有两种类型的受体即ETRA和ETRB，它们均通过细胞内G-蛋白传递细胞外信号[20]。ETRA主要位于血管平滑肌细胞表面，它与ET-1的亲合力最强，约是与ET-3亲合力的100倍。ET与其受体结合介导血管平滑肌的收缩。ETRB与ET结合后产生的效应主要决定于细胞类型，如ET与内皮细胞自身的ETRB结合，可引起NO的释放及血管平滑肌松弛；若ET与血管平滑肌细胞上的ETRB结合，则可诱导平滑肌的收缩[21]。大鼠肝贮脂细胞表面的ET受体量远高于内皮细胞、Kupffer细胞和肝细胞等，若用ET-1灌注肝，可引起肝血窦收缩，光镜和电镜放射自显影术研究发现，ET-1主要与贮脂细胞结合。另外，用核酸杂交和竞争结合分析研究也证明[22]，贮脂细胞既表达ETRA又表达ETRB，ETRB还与细胞的生长分化调节有关。应用高能活体显影观察证实[17]，贮脂细胞表面丰富的ETRA与ET结合可致细胞发生很强的收缩作用。P物质、去甲肾上腺素与和血栓素等也能引起贮脂细胞的收缩，但作用较ET弱。

　　内皮细胞源性NO是一种血管舒张因子，它是在一氧化氮合酶（NOS）的作用下由L-精氨酸和氧分子结合而生成的。NOS有二种同工异构型：组织型NOS（原生OS，cNOS）和诱那里型NOS（iNOS）。cNOS依赖钙-钙调蛋白系统，产生的NO较少，参与细胞正常生理状况下的机能调节；iNOS在正常状况下不表达，也不依赖钙-钙调蛋白系统，在内毒素和某些因子刺激下才表达，产生大量的NO。可能由于内毒素和细胞因子影响核因子Kb/rd活性，后者激活iNOs基因的转录，从而使细胞产生大量NO[23]。

　　近来研究发现[24]，内皮细胞分泌NO又对自身的NOS的合成产生负调节效应。NO半衰期极短，仅30秒。NO可弥散入血管平滑肌细胞内，通过与细胞内Ca2+的结合，激活可溶性cAMP，使平滑肌松弛，血管舒张。肝贮脂细胞体外培养研究表明，外源性NO能阻止ET-1诱导贮脂细胞收缩；无论在含有或不含有内毒素或细胞因子的条件，贮脂细胞也产生NO，并以自泌方式作用于自身。

　　我们实验室的研究表明[25]，正常大鼠HSEC强烈表达ET-1，在肝纤维增生性病变时，HSEC表达ET-1明显减弱；用原位杂交和免疫组化法从核酸水平和蛋白水平的研究均证实，正常大鼠HSEC表达cNOS，产生少量NO，而在肝纤维化时，iNOS表达增强，NO的产生明显增多，这可能与肝病理状况下产生的一些因子作用于HSEC有关。

　　由此推测，正常HSEC生成的NO和ET-1，两者通过旁泌作用于邻近的贮脂细胞，调节和稳定肝微循环血流，在肝纤维化时HSEC合成ET减少，而NO的产生相应增多，使血窦扩张，进而改善肝纤维增生时肝血循环障碍。也有实验看到，给肝纤维化大鼠门静脉灌注NOS底物L-精氨酸，可降低门静脉对去甲肾上腺素的敏感性。表明肝内产生的NO有一定的降门脉高压作用[26]。由此可见，HSEC产生的ET和NO既有稳定正常肝微循环的作用，又与肝纤维化等病变的发生发展相关，尤与门静脉高压的形成有关。若将ETRA拮抗剂Bosentan灌注给肝纤维化并伴有门脉高压的大鼠，可降低门静脉压力，目前这一复合物已用于临床治疗[27]。倘若能有效控制肝内ET和NO的合成及其作用，可能有利于改善门脉高压。

　　5 HSEC表面受体和粘附分子的表达

　　HSEC的表型及其相应的生物学特性与其他内皮细胞有一定的差异。HSEC表达其他内皮细胞不表达某些受体如IgG的Fc受体、CD13、CD14等以及一些粘附分子如ICAM-1、CD4、α5β1、α1β1。HSEC不表达其他血管内皮细胞表达的分子，如C62、CD31、CD34等。这可能与HSEC所处的微环境有关[28-34]。

　　5.1 HSEC清除作用的相关受体表达

　　IgG的Fc段受体：实验研究证明，除胎盘血管内皮及肝HSEC表达IgG的Fc受体（FcR）外，其他正常血管内皮细胞均不表达FcR。IgG的FcR可分为FcRⅠ、FcRⅡ（CDw32）FcRⅢ（CD16）三种。HSEC仅表达FcRⅡ和FcRⅢ两种受体。我们以EA花环实验研究发现[28]，HSEC表达的FcR活性，在相应抗体介导下可与羊红细胞形成花环。应用FcR单克隆抗体及胶体金标记羊抗鼠IgG的电镜免疫组化法，可见HSEC表面与枯否细胞一样有数量不等的胶体金颗粒，更明确证实HSEC表达FcR；在HSEC内吞泡内也可见胶体金颗粒，提示FcR与免疫复合物结合并内吞入胞质内[25]。有研究认为，HSEC主要摄取血循环中可溶性免疫复合物，在溶酶体内被降解消化，但至今尚无直接证据表明HSEC有抗原递呈作用。在多数情况下，肝血窦中枯否细胞呈MHC-Ⅱ阳性，而且均表达HLA-DR和HLA-DQ，但很少看到HSEC具有HLA-DR活性，而HLA-DR在抗原递呈中起重要作用。因此，正常情况下的HSEC可能不具有抗原递呈作用，但不排除病理情况下被诱导而具有抗原递呈作用。

　　CD14和CD13：CD14是脂多糖结合蛋白受体。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性杆菌膜上的复合物，可刺激内皮细胞分泌细胞因子，可诱导机体产生非特异性免疫功能。HSEC上的CD14主要在处理血循环中的LPS-LPS结合蛋白复合物中起着重要作用。CD13是氨基肽酶-N受体，该酶可降解一些小分子多肽，参与小分子肽的调节。除HSEC表达CD13外，肝细胞胆小管和小叶间胆管上皮细胞顶部质膜也可检测到CD13，但在肝的其他血管腔面均未检测到。

　　其他受体：肝内有两套清除异物的细胞系统，即Kupffer细胞和HSEC[33]。前者吞噬清除颗粒性异物，后者通过受体介导吞饮可溶性的和小微粒性异物。HSEC有透明质酸受体、胶原α链受体、甘露糖受体、LDL受体等净化受体，分别清除细胞外基质成分和代谢产物，维持机体内环境的稳定。将荧光素标记的Ⅰ型前胶原N-末端肽或碘化AcLDL注入肝内，仅见HSEC内含有这些标记物，体外研究也有类似结果。因此，这些受体可作为鉴别HSEC的特异标志。

　　5.2 HSEC的细胞粘附分子表达

　　细胞粘附分子（cell adhensive moleculer,CAM）是细胞表面的一类糖蛋白，在细胞与细胞间结合、细胞与细胞外基质间的结合中起粘附作用，在维持正常组织结构以及炎症反应、免疫应答和肿瘤扩散转移等许多生理病理过程中发挥重要作用。目前依据基因结构的同源性和功能特点将CAM分为几类，如选择素（selectin）家族、整合素（integrin）家族、IgG起家族等。目前已知，正常HSEC表达以下几种CAM[30、35]。

　　α1β1和α5βL：二者属整合素家族的VLA组（very appeal;antigen VLA），同时还较弱地表达αVβ3和α11β3。这些整合素均是纤维粘连蛋白（NF）的受体，α1β1也是一种胶原受体，αvβ3和α11β3和11β3。可能与血管基膜的vWF或玻璃粘连蛋白（vitronectin）结合。HSEC表达这些粘附分子与肝窦周隙内含有的相应配体相关。正常肝窦周隙内有Ⅳ型和Ⅵ型胶原蛋白与FN，但无层粘连蛋白（LN），而HSEC也无LN的受体（α2β1、α3β1、α6β1、α6β4等）。但在肝硬化时，血窦壁出现明显的基膜（含LN），毛细胞血管化的HSEC也强烈表达α6β1和α2β1，而LN是毛细胞血管形成的重要诱导物。若事先用LN抗体处理，则能阻止HSEC的毛细胞血管化[35]。

　　ICAM-1和CD4：二者属于IgG超家族。此类粘附分子和免疫球蛋白可变区或恒定区有类似之外，功能性氨基酸也有一定的同源性，故称为IgG 超家族。细胞间粘附分子（ICAM-1，CD54）能与白细胞上的LFA-1（CD11α/CD18）结合，其功能与CD4相似。淋巴细胞粘附分子（CD4）可与HLA-DR结合，可介导白细胞或表达有HLA-DR的细胞粘附到HSEC上，可能与抗原递呈有关。CD4又是人免疫缺陷病毒受体。Kupffer细胞表面有HLA-DR和LFA-1，故推测正常HSEC表达ICAM-1和CD4可能与枯否细胞和淋巴细胞粘附于血窦壁上有关。

　　CD44：CD44是一种高度异质性的单链跨膜糖蛋白，广泛表达于各种血细胞、上皮细胞及多种瘤细胞的表面。不同细胞表达CD44的水平和类型差异很大，根据细胞表达CD44的分子量差异可将其分为3类：（1）80-90KD类，广泛分布于各种血细胞和多种间质细胞，通常称为标准型。此类CD44与透明质酸有较高的亲和力，是透明质酸的主要受体。（2）110-160KD类，主要表达于上皮细胞，一般不与透明质酸结合。（3）180-215KD类，表达量较少。CD44的配体是细胞外基质。HSEC上的透明质酸受体与CD44明显不同的是前者是由分子量为175KD和166KD两个多肽共同组成的[36]。正常HSEC表达CD44较弱，肝硬化时，也无明显变化。

　　正常HSEC不表达CD62（PADGEM），CD31（PECAM）及CD34，这三种分子也是连续型毛细血管内皮细胞的特征性标志。但在肝炎症时，HSEC则超量表达这三种分子，可能与炎症时HSEC的毛细血管化的变化有关。研究证实。血管内皮细胞超量表达PECAM-1是与血管形成有关的[37]。

　　HSEC表达粘附分子与肿瘤转移相关。肿瘤细胞经血行转移是个复杂过程，受多种复合因素调节。首先是癌细胞突破细胞外基质及血管壁进入血液，循环中癌细胞与血管内皮细胞（主要是毛细血管）的接触反应是发生转移的关键一步[38]肝脏是肿瘤细胞经血液转移的好发部位，这一方面由于胆具有独特的血循环特点，同时也与HSEC表达粘附分子有关。体外研表明[39]，高转移性肝癌细胞转移珠H59与原代培养HSEC粘附性较低，若无用TNFa处理HSEC，H59与HSEC的粘附性明显增高，而此过程可被MAb9a6(中性E-选择素单克隆抗体)特异地阻止。另外两种高转移性的人结肠癌株也有类似现象，而低转移性细胞株则无此现象。由此推测，正常HSEC不表达E-选择素，但在癌症时产生的细胞因子的刺激下，HSEC表达E-选择素，而高转移癌细胞表面有相应的配体，两者结合可介导高转移癌至肝实质内。

　　肝腺泡各带内的HSEC如同肝的其他非实质细胞一样，不仅有形态结构的差异，而且还有表型的差异[40]。Ⅱ带和Ⅲ带HSEC不表达IF-10抗原（是连续型毛细血管内皮细胞的标志），但表达特异标志CD14和CD16；Ⅰ带内的HSEC则表达IF-10抗原，而缺乏CD14和CD16；而CD4、CDw32、CD13以及其他粘附分子的表达，各带HSEC无明显差异。肝腺泡各带HSEC的IF-10的表达不同，可能与腺泡各带微环境不同而影响HSEC的分化有关。肝腺泡Ⅰ带HSEC缺乏CD14和CD16，肝血流中的IgG与Ⅰ带HSEC的亲合力低于Ⅱ带和Ⅲ带，故Ⅰ带HSEC的清除功能也逊于Ⅱ带Ⅲ带。

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