细胞凋亡研究进展

　　生物体内环境的稳定，不但依赖细胞增殖和分化，也依赖于细胞的凋亡。细胞凋亡（apoptosis）又称编程性死亡，是生物界重要的生命现象之一。从线虫至高等哺乳类动物，从胚胎至成人，从生理到病理，从生到死整个过程，体内不同的细胞多具有此种死亡形式。早在100多年前Carl Vogt 已发现这种死亡形式［1］。1972年Kerr等人重新提出研究，并命名为凋亡（apoptosis）。其后在凋亡的形态学和生物化学等领域取得新的认识。近期的研究在3方面有明确的进展。首先，从研究小线虫（C. elegans）凋亡调节基因，证实凋亡的发展是由遗传基因控制，其中以Ced-9, Ced-3和Ced-4基因的作用最先确定，哺乳动物也有相应的同源基因［2］。其次，阐明凋亡信号传递途径，特殊的死亡信号分子激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族（称为caspases），诱导细胞凋亡。第三，研究了凋亡和一些疾病的关系，了解疾病发病机制及应用凋亡理论和实践来防治疾病。

　　一、细胞凋亡的形态学和生物化学改变

　　细胞凋亡的形态改变［3］是多阶段的，首先是细胞缩小，胞质凝缩，内质网疏松并和胞膜融合，核糖体、线粒体等聚集，但结构无明显改变。染色质逐渐凝集成新月状，附在核膜周边，嗜碱性增强。以后细胞核固缩成均一的致密物，进而核碎裂，胞膜完整。继之核膜出芽，固缩染色质脱落，形成膜包凋亡小体（apoptotic bodies）。最终凋亡小体被周围吞噬细胞吞噬降解。

　　随着细胞凋亡形态的研究，细胞生化的改变也逐步被阐明。（1）钙离子和蛋白激酶改变：细胞内Ca2+的堆积和重新分布，细胞核内Ca2+的增多［4］， 激活核酸内切酶的活性，蛋白激酶C在不同细胞类别和不同周期活性表现不一。（2）核酸内切酶激活［5］把DNA内切成180碱基对倍数的核苷酸片段，呈梯状电泳现象。（3）组织谷氨酰胺转移酶的积累并激活。（4）细胞骨架如肌动蛋白的变化。（5）细胞表面糖链、植物血凝素与玻连蛋白受体增加，磷脂酰丝氨酸的外露改变细胞表面的生化特性。

　　二、凋亡产生的3步骤

　　凋亡的发生和发展概括为3个阶段［6］：信号传递阶段、中央调控阶段和结构改变阶段。

　　1．信号传递［7］：诱导凋亡的细胞外因素（包括环境因素和体内因素）众多，进入细胞内是经信号传递阶段。各种诱导凋亡因子进入细胞内的途径是多种多样的，其中主要的是通过受体介导。接受凋亡信号的受体位于细胞表面， 称为死亡受体（death receptors, DR），当死亡配体（death ligands ）和它结合激活死亡蛋白酶系统（death caspase）可以在几小时内诱导细胞凋亡。 死亡受体有肿瘤坏死因子受体基因家族，CD95（Fas或Apol）和DR（或APO）系列。死亡受体分为细胞膜外和胞质两区域，前者传导死亡信号，后者称死亡区域（death domain），参与激发蛋白酶系列和细胞产生凋亡调节机制［8］。

　　2．中央调控：凋亡激发因子作用在线粒体，使线粒体内死亡基因ced-3／白细胞介素1β转化酶(ICE)和ced-4 （ced为线虫基因，ICE为哺乳类基因）及死亡抑制基因ced-9/bcl-2（ced-9 在线虫体内，哺乳类动物相应基因为bcl-2）激活，两者何居优势，决定细胞存活或凋亡。当ced-9／bcl-2 和ced-4（连接蛋白）和ced-3／ICE相结合，ced-3不能活化，防止一连串caspases 级联反应，细胞存活［9］；当ced-9／bcl-2被促凋亡因子EGL-1结合，bcl-2失活，ced-4使ced-3／ICE活化引起细胞凋亡。线粒体释放细胞色素c（Cyto c）亦可使caspases活化，产生蛋白溶解，引起细胞凋亡。

　　3．细胞结构改变：在前两阶段基础上，凋亡细胞出现特异的形态变化如细胞皱缩，核致密，微绒毛消失。生化特点是多种酶活化。细胞核的改变，认为是caspases活化的DNA酶（CAD）进入细胞核内使染色体的DNA断裂引起细胞死亡［10］。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD［11］。

　　三、凋亡发展的中心问题

　　最近，凋亡发展过程的研究最关注的是线粒体的作用、蛋白酶系统的级联反应（caspase cascade）和各种死亡基因及其产物的调节作用。

　　1．线粒体：在原核细胞内线粒体前身是一种小的共生细菌，它控制细胞在有氧环境下的生活和死亡。这种共生菌的存在由不稳定至稳定及参加核基因谱变成专性共生，是细胞进化现象［12］。细胞内氧化磷酸化，能量代谢和抗活性氧化有赖于线粒体的功能。线粒体的早期改变为线粒体膜通透性变化和线粒体转膜电位（mitochondrial transmembrane potential）降低［12］，膜间孔开放，离子通过，内膜H+梯度破坏，基质渗透压升高，线粒体体积扩大，外膜破裂。caspases活性蛋白释放至胞质引起caspases连锁反应；线粒体转膜电位降低， 呼吸链解偶联，过氧化阴离子产物增加，基质钙和谷胱甘肽外流，可溶性膜间蛋白，包括Cyto c释放，激发胞质半胱氨酸蛋白酶的连锁反应，产生细胞凋亡或坏死。故线粒体膜间孔大小、线粒体转膜电位调节细胞凋亡。线粒体改变引起细胞死亡已知有3种机制［13］：（1）电子传递、氧化磷酸化和ATP产生的破坏。（2）释放激发caspases家族的蛋白，如Cyto c。（3）改变细胞氧化还原潜能。死亡类型（凋亡和坏死）不同决定于线粒体的改变。例如，当激发因子如Bax、Ca2+、神经酰胺刺激线粒体，结果有二种，一是渗透性不平衡使线粒体肿胀，外膜破裂，电化学梯度破坏和ATP减少使细胞坏死。一是线粒体外膜透性增加，释放Cyto c，激发caspases蛋白溶解酶，产生细胞凋亡。

　　2．caspases蛋白酶［14］：凋亡是一种进化过程中保留下来的细胞自杀，发生的机制是蛋白溶解系统活化，涉及一组半胱氨酸蛋白酶家族，称为caspases。caspases家族具有蛋白酶的生物学特性：如蛋白溶解作用是不可逆的；许多蛋白酶是由其原无或极少催化作用的前体合成，其量虽少，起着催化作用；存在阳性或阴性反馈作用；蛋白酶能调节自身的活性；蛋白酶有其相应的抑制剂；蛋白酶反应是特异性的等。蛋白酶前体可在天冬氨酸位点上被切断成3部份，H2N-端是抑制区域被移去，另一端COOH-端断裂成1大1小亚单位称为死亡区域，2大2小亚单位结合成活化酶，可以作用下游效应caspases，这种级联反应称为caspases cascade［14］（图1）。这种连锁反应的进行有赖于caspases的调节蛋白、辅助因子、反馈关系和阈限等控制。如凋亡外界信号只作用于caspases前体（procaspases），前体可活化蛋白酶激发因子（initiator of caspases），激发因子可以活化蛋白酶效应因子（effector of caspases），然后作用于底物蛋白，如核层蛋白（laminine），PARP（poly-ADP-ribos polymerase），DNA碎裂因子（DFF-45）和gelsolin等，蛋白分解引起凋亡。caspases有多种，多数和凋亡有关，少数和炎症有关［14］。

图1　蛋白酶级联反应

　　3．细胞凋亡的基因调控：目前发现的细胞凋亡有关基因有3类，促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因和在细胞凋亡过程中协助的基因。（1）ced基因［6］：线虫的ced-3和ced-4为促凋亡基因，哺乳类动物和ced-3相似基因为ICE，是一种半胱氨酸蛋白酶；ced-9是抑制凋亡基因，人的bcl-2和ced-9同源，可以抑制ced-3。ced-4是结合体（adaptor）。（2）bcl-2及其家族：bcl-2家族有Bcl-x，Bax，Bak，Bad等成员，形成Bcl-2-Bax-Bclx和Bax-Bad-Bcl-x 调控系统。bcl-2 可以防止凋亡产生［15］，与肿瘤细胞增殖和癌变有关，部分成员如Bax有促进凋亡作用［16］。（3）ICE基因：是哺乳类动物促凋亡基因。ICE作用于Pro-IL-1β底物。抑制ICE的基因有Cowpox病毒的Crm A，能使其失去诱导细胞凋亡作用。Cpp32基因产物可以和ICE协同作用。（4）c-myc和h-ras基因：c-myc促进细胞凋亡，h-ras抑制细胞凋亡［17］。（5）Fas和Fas配体（Fas-L）：Fas为死亡受体，Fas-L是T淋巴细胞产物，Fas和Fas-L结合诱导细胞凋亡。（6）p53基因：野生型诱导细胞凋亡，通过细胞凋亡抑制肿瘤的生长［17］。它作用在细胞周期和细胞受损伤时，促使细胞凋亡。（7）Rb有抗凋亡作用，Rb使细胞周期停滞，也可阻断细胞内信息传递。 也有报道放射线诱导细胞凋亡可由Rb蛋白介导［18］。

　　四、凋亡在疾病的防治中应用的可能性［1，8，14］

　　应用caspases理论及凋亡发生机理探索防治疾病方法，正在从动物实验和临床两方面进行，药物研究也方兴未艾，但治疗成功的人体病例不多，目前用在临床防治的疾病包括如下几类：

　　1．脑缺血神经细胞凋亡可以用caspases抑制剂防止。如新生儿窒息［19］，老年脑缺血，老年痴呆症（如Alzheimers病）［20］可用药物预防神经元凋亡。

　　2．过度凋亡所致疾病的防治：神经退行性变疾病，视网膜退行性病变，移植排斥，自身免疫性疾病等由于过度凋亡引起细胞缺失，可用caspases抑制剂预防［14］。

　　3．肿瘤防治：肿瘤细胞常呈凋亡不足，化疗和放疗可诱导肿瘤细胞凋亡，通过活化caspases酶系统或活化死亡受体启动caspases系统，促进凋亡。应了解某种肿瘤细胞启动的caspases酶系统和正常细胞死亡caspases酶系统的差异，以便选择激发肿瘤细胞的caspases系统。另外，肿瘤细胞可能是bcl-2表达过度，p53表达不足或突变使肿瘤细胞死亡减少，也可据此设计治疗策略［8］。

　　4．心肌缺血，心肌梗死：在急性条件下，心肌纤维多为坏死，有些缓慢发展的心肌缺血可产生心肌细胞凋亡，通过了解凋亡的发生过程可以预防和治疗慢性心肌纤维死亡［8］。

　　5．有些病毒感染可以阻止细胞凋亡，使病毒得以在活细胞繁殖。利用病毒或其蛋白产生抑制caspases系统或利用小分子多肽来防止凋亡［8］。

　　探索防治与细胞凋亡有关的疾病，目前提出对肿瘤、老年痴呆、艾滋病、自身免疫病等，根据凋亡理论制定治疗策略。需依赖几个领域的研究进步：（1）根据不同疾病细胞凋亡过程特点设计治疗方案；（2）市场上能提供有关药物；（3）基因治疗，ICE／ced-3基因家族产品的应用；（4）凋亡的诊断和研究方法的改善，关键是了解不同caspases活化在细胞凋亡作用及其上、下游的各辅助因子的作用。

　　五、结束语

　　近年来，有关细胞凋亡的研究飞速发展，并有所突破。对caspases 系列的研究将更深入，caspases 上游基因和下游的作用底物及各种协作因子将一一被阐明。促caspases因子和拮抗因子将制成药品推向市场，由于对有关疾病产生细胞凋亡机制的深入了解，并找出其特异性，可应用于疾病的防治，成为治疗学新领域。因此，细胞凋亡理论和实践的研究将有广阔的天地。

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