全国端粒酶、p53和细胞凋亡的研究及应用研讨会

　　由中华医学会病理学分会和中华病理学杂志编辑委员会主办的全国端粒酶、p53和细胞凋亡的研究及应用研讨会，于1999年4月20日至25日在福建省福州市召开。来自全国各地的146名代表参加了本次会议。会议共收到论文130篇，其中大会交流26篇。这些论文主要涉及端粒酶、p53和细胞凋亡的检测方法、判断标准及其在肿瘤发生、发展中的分子机制以及应用意义。这些论文基本反映了我国目前在这些领域研究的新水平、新成果。会议进行得紧凑而又活跃，代表们互相磋商、讨论热烈，对当前存在的一些问题进行了有益而深入的探讨与交流。

　　一、有关端粒及端粒酶的研究

　　近几年来有关端粒及端粒酶活性与癌的关系的研究是国内外文献的热点。在老化过程中人的体细胞每次分裂后染色体的末端逐渐丢失而缩短，但癌细胞和永生化细胞则可维持其端粒长度。这是因为癌细胞和永生化细胞以及生殖细胞等表达一种重要的核糖蛋白（ribonucleoprotein）酶即端粒酶。上海医科大学朱虹光、白求恩医科大学吴珊分别就“端粒酶的研究进展，存在问题及其在病理学中的应用”(见本期58页)、“端粒酶与癌症”作了专题报告，北京协和医院刘彤华进行了总结。端粒酶的RNA和蛋白成分对端粒DNA的合成很重要，它可维持端粒的长度而使细胞永生化或成癌。大量研究证实人体大多数癌和其他的恶性肿瘤中均能检测到端粒酶活性。Shay等［1］总结3 500例恶性肿瘤及其对照的端粒酶活性，90%以上的恶性肿瘤表达端粒酶活性而相应的良性肿瘤则为阴性或仅有少数阳性。端粒酶活性强的肿瘤有小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、皮肤鳞癌和基底细胞癌、神经母细胞瘤和高度恶性的淋巴瘤等。端粒酶的阳性表达不仅与肿瘤的良恶性有关，而且可能与肿瘤分化（分化越差表达越强）、复发和转移有关，因而许多学者认为端粒酶活性可以作为恶性肿瘤的标志和预测预后的指标。由此设想用抑制端粒酶活性的方法将有可能达到抑制恶性肿瘤生长的目的，为肿瘤的基因治疗开辟新的前景。

　　但是也有研究表明有些人的永生化细胞并不表达端粒酶活性却能保持端粒长度。敲除端粒酶RNA的小鼠到第6代时仍很健康，说明端粒酶活性对小鼠的存活并不重要。这些研究结果表明，除端粒酶活性外在肿瘤和永生化细胞中还存在其他机制或旁路来维持端粒的长度。

　　Yan等［2］对人体肉瘤的研究发现，良性软组织肿瘤和低度恶性的肉瘤均不表达端粒酶活性，仅50%的中度和高度恶性肉瘤表达端粒酶活性。平滑肌肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤很少表达端粒酶活性。这些作者还证实不表达端粒酶活性的肿瘤并不是因为存在端粒酶抑制物。因此这些作者认为端粒酶活性不能作为肿瘤的诊断标志，亦不能作为预测预后的指标。

　　正如一篇文献的题目，“癌组织中的端粒酶活性：到底是一颗神奇的子弹？还是一种海市蜃楼（Telomerase activity in cancer：a magic bullet or a mirage？）。答案还有待我们大家努力去探索和研究。

　　二、p53研究的新进展

　　肿瘤抑制基因p53的不正常是人类及动物肿瘤中最常见的分子事件，p53蛋白也是现代分子生物学中研究的最多的蛋白质之一，国内外有关p53的研究论文已超过12 500篇［3］。在本次会议中有关p53的研究论文所占比例也较大。北京医科大学郑杰作的专题报告“p53研究中的几个问题”，较详尽地介绍了p53的功能及作用特点。p53具有细胞生长阻滞作用，这种作用可出现在G1及G2期细胞。由于DNA损伤引起p53蛋白水平升高，通过转录激活作用导致p21WAF1/CIP1表达上调，进一步可诱导mdm2表达。mdm2同时可介导p53降解。p53具有诱导凋亡的作用，这种作用与其引起的细胞生长阻滞作用在结构及功能上都是分离的，并可以通过其转录靶点和非转录机制而实现。p53具有肿瘤抑制作用，与生长发育有关：敲除p53的小鼠易发生中枢神经系统等发育异常及各种自发瘤。p53基因遗传学改变包括：错义突变，无义突变，丢失或插入，等位基因丢失。从功能上可分为：沉默突变，丢失野生功能的突变，不显性突变，Gain-of-function（此种突变的p53可起到癌蛋白的作用，也可起到野生型p53作用），假突变。p53不能单独发挥抑癌作用，需与p33协同。最近在哺乳动物p53家族又发现了2种新的成员：p73和p51［4］。两者均与p53有同源性，至少在过度表达时可激活p53反应启动子，并能诱导凋亡。北京医科大学吴秉铨在总结中指出p53研究是随着p53基因突变检测手段的发展而逐步深入的，大体可分为3个阶段：（1）用免疫组化方法检测蛋白的积聚，蛋白水平的阳性率不能说是突变率，只是意味着可能有基因突变存在；（2）用单链构象多态性分析(SSCP)检测p53基因突变，认识到p53蛋白阴性并不等于该基因无突变，因为p53的错义突变才会有p53蛋白的阳性；（3）变性梯度凝胶电泳（DGGE）及测序，特别是测序是检测p53基因突变的金标准，可用来研究点突变。过去野生型p53被认为是抑癌基因，而突变型p53则起癌基因的作用。现认为p53基因上某些位点突变后形成的p53基因仍具有野生型p53的特性，并认识到了p53基因“假突变”、“假野生型”的现象。假野生型p53基因在抑制细胞增殖的作用上可以比真野生型还要强，因为参与调节的mdm2基因表达状态可能不同。对p53基因进行研究仅仅检测一个指标是不全面的，要同时检测其上、下游基因（如p21基因和Bax基因）或与其对立的基因（如bcl-2），共同研究意义更大。

　　三、有关细胞凋亡的研究

　　汕头大学医学院沈忠英的专题报告“细胞凋亡研究新进展”，对细胞凋亡的形态改变、主要的发生机制和目前常用的检测方法作了详细的阐述(见本期63页)。中国医学科学院基础医学研究所佘铭鹏对有关细胞凋亡的研究进行了总结。他指出，近20年来，国内外通过对细胞凋亡发生的分子生物学机理的研究，对其本质的认识不断深入。这一过程和细胞生长、分化、消亡以及和机体许多生理和病理过程，诸如细胞坏死、肿瘤的发生和发展、动脉粥样硬化的斑块形成，破裂的发生和发展等均有密切关系。但由于它的发生机制非常复杂，而目前检测手段还不够精确，故对其本质的认识仍很不全面。所以这些年来，各人根据所观察的结果，对细胞凋亡与一些重要疾病发病关系的重要性，认识不一。美国《科学》杂志1998年8月在一期中发表了数篇论文［5-7］，概述对细胞凋亡发生机制的一些新发现和新论点。目前对细胞凋亡的看法，虽不象过去那样认为它涉及的范围非常广泛，但它仍然是细胞很重要的一个生理发展程序，只是目前对它的发生机制尚未搞清，因此对其重要性也还有待进一步明确。

　　凋亡细胞的特异性形态改变，核内DNA经核酸内切酶降解后所产生的寡核苷酸片段（180～200 bp倍数），在琼脂糖凝胶电泳时所出现的特征性DNA梯形区带图谱［8-10］，仍是目前常用的鉴定方法。近年来比较简便和较多使用的TUNEL技术，是根据凋亡细胞核内DNA被切割后，裸露出游离的3′末端，应用末端转移酶将经生物素标记的dTTP连接到3′末端上的原理，做为识别凋亡细胞的标志［11］。经验证明，TUNEL方法的主要缺点是对一些细胞核出现非特异性标记，使一些具有基因转录活性的非凋亡细胞也出现阳性反应。此外，这种方法还可能标记上一些非核结构。对于这一点，目前用EDTA或柠檬酸将组织切片进行预处理可以避免它的发生。由于以上种种假象，所以在应用TUNEL技术时，还需以细胞形态学特征或DNA的梯形图谱做为旁证指标才比较可靠。

　　这些年来，通过对线虫caenorhabitis的研究，至少已发现14种基因和线虫的细胞程序性死亡密切相关，如ced-3 和ced-4能促进细胞死亡，而 ced-9 又能抑制细胞死亡。已知ced-9在哺乳动物和bcl-2 同源。此后又陆续地鉴定了11种ced-9 的人类同源体。这12种基因统称为bcl-2/ced-9 家族，其中可抑制或促进细胞凋亡功能的各有6种［6，11，12］。ced-3 和IL-1β转换酶（interleukin 1 β-converting enzyme，ICE）高度同源。ICE是一种促进细胞凋亡的蛋白酶。后来又陆续鉴定出10种和它同源的酶。目前这11种ICE/ced-3 家族统称为caspase，它有半胱氨酸蛋白酶活性，有在天冬氨酸之后切割蛋白的功能，对细胞凋亡的发生，起着关键性作用。

　　在发生细胞凋亡时，先出现没有活性的 caspase 前体(procaspase)聚集并自我激活。目前认为有两条通路可以激活下游的caspases 并导致细胞凋亡。其一是死亡受体，例如Fas和肿瘤坏死因子(TNF)受体,先结合接头蛋白(adaptor protein)和caspase 前体。当然这一机制非常复杂，对它的了解也还不全面,但细胞凋亡的发生需要通过受体结合接头蛋白如RAIDD的CARDs(caspase recruiment domains)间的相互作用。 接头蛋白不但可以直接和Fas结合,也可间接地和 TNF受体结合，导致caspases 前体积聚并自我激活 （如caspase-2、-8）。激活的caspases 切割并进一步激活下游的caspases。第二条通路为细胞色素c/dATP依赖性,由线粒体释放细胞色素c。细胞色素c结合人细胞凋亡蛋白激活因子-1（Apaf1）通过CARDs-CARDs相互作用。Apaf1可形成寡聚物(oligomer)。caspase-9前体通过寡聚作用(oligmerization)自我活化，进而激活下游caspases 包括caspase-3、-6及-7［13］。

　　目前认为Bid（含有bcl-2家族成员的功能区），是Fas细胞凋亡信号通路中的一种特异性底物。被死亡受体如Fas, TNF激活的caspase-8可切割bcl-2家族的Bid，裸露的C末端可结合在线粒体上导致释放细胞色素c，Bid经caspase-8 切割可以放大Fas/TNF细胞凋亡信号。胞质内的Bid保有其全长，经修剪后的tBid,能将细胞凋亡信号自胞质传递至线粒体使之释放细胞色素c［14-16］, 引发第二条通路。提示上述两条通路有交叉［14-16］。

　　bcl-2 是位于线粒体外膜的膜蛋白。它的过度表达可抑制线粒体释放细胞色素c因此也抑制了细胞凋亡［17］。也可能通过抑制由 Fas和 Fas-L 介导的caspase-8 激活Bid，阻止了第二条通路的启动，从而抑制了细胞凋亡。

　　近些年来，检测凋亡细胞的方法又有了进一步发展。应用重组基因技术及表达的蛋白和所制备的抗体以及 ELISA或免疫组化技术已可检测 caspases, 细胞色素c ,bcl-2 家族蛋白质和 Fas, TNF,TNF受体的活性或表达情况。还开始应用TNF, bcl-2 以及 survivin DNA探针检测相应的RNA 表达作为凋亡细胞指标。其中以免疫组化技术检测 caspases更简单可行，有可能较单一使用TUNEL方法可靠。但还需有更多的实践经验才能对凋亡细胞的监测指标和它的重要性有进一步的认识。

　　通信作者：常秀青，中华病理学杂志编辑部，100710

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