成骨细胞的成骨作用及复合移植研究进展

　　大型骨缺损常见于恶性肿瘤切除术后、严重的交通伤、火器伤和放射性骨髓炎等，治疗难度较大。治疗方法有带血供的自体骨移植(始于70年代)、人工骨、诱导成骨材料和异体骨移植等，其中以带血供的自体骨移植疗效最佳。但自体骨来源有限，且可能在供区造成继发性损失或并发症，而现有的人工骨、诱导成骨材料和异体骨等均达不到自体骨的效果，为此，进一步寻找尽可能达到或接近自体骨移植效果的替代材料一直是基础和临床研究的热门课题。近年来日趋活跃的组织工程技术有可能为这一课题带来新的亮点和希望，为此，我们着重就骨组织工程中的两大基本因素-成骨细胞及其载体作一综述。

　　1　成骨细胞的来源

　　成骨细胞属结缔组织细胞，其前体为来源于原始间充质(mesenchyma)的骨祖细胞(或称骨原细胞、前成骨细胞)。早在1976年，Friedenstein［1］就将骨祖细胞分为两类，一类称为定向性骨祖细胞(determined osteogenic precursor cells,DOPC)，它们存在于生骨区，如骨髓基质、骨内膜、骨外膜(生发层)及骨骺板中，不需任何诱导因子的参与即能适应机体生长发育、再生修复的需要而自动分化为成骨细胞；另一类称为诱导性骨祖细胞(inducible osteogenic precursor cells,IOPC)，它们是非生骨区的间充质细胞，广泛分布于体内的许多组织，包括非骨髓淋巴生成器官(胸腺、脾等)的基质细胞、毛细血管周细胞、网状细胞、内皮细胞、成纤维细胞及星状细胞等，这些细胞不能自发向成骨转化，但当施加诱导因素如泌尿道上皮、脱钙骨基质或BMP等时，则具有骨形成能力，能产生异位骨化。

　　2　体外培养成骨细胞的成骨能力

　　体外分离培养成骨多以定向性骨祖细胞所在部位为主要取材处。目前，已能从鼠、兔、鸡和人等不同物种的骨髓基质、骨外膜以及松质骨(含有骨内膜)等处成功分离培养出成骨细胞，并传代扩增，为研究成骨细胞的生长代谢和成骨机理提供了重要手段。有学者［2，3］在大鼠骨髓基质细胞培养液中加入地塞米松和β-甘油磷酸钠等控制因素，利用地塞米松诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化，并激活其碱性磷酸酶活性；以β-甘油磷酸钠作为碱性磷酸酶的底物促进有机磷向无机磷转化，加速生理性钙盐沉积，使培养的成骨细胞形成了钙结节。Koshihara［4］等培养从人骨膜分离出来的成骨细胞，发现细胞可由单层长成多层，并具有很高的碱性磷酸酶活性，同样能钙化成骨，加入β-甘油磷酸钠后钙化加速。而作为成骨细胞分化成熟重要检测指标的碱性磷酸酶活性，在体外培养传至第15代时仍与原代一般［5］。Tenenbaum［6］对由小鸡成骨细胞体外培养所形成的钙化组织进行了超微结构研究，显示其主要成份为钙和磷，与羟基磷灰石的结构相似。以上及其它类似的研究结果均表明，与普遍认为不具有分裂增殖能力的在体成骨细胞不同，体外培养的成骨细胞具有旺盛的分裂增殖能力，并能钙化形成新骨，这为体外扩增成骨细胞然后回植体内促骨形成奠定了实验学基础。

　　3　单纯成骨细胞移植的成骨能力

　　成骨细胞能分泌骨基质并随着钙盐的沉积而成骨，在骨的发生、骨折愈合及骨缺损修复中起着非常重要的作用。早在100多年前，就有人试图利用成骨细胞的这一特性来促进骨折愈合，这主要体现在利用富含成骨细胞的骨膜移植治疗骨折和骨缺损这一方法上。成骨细胞分离培养技术的建立，使这一研究更加深入和更具针对性。Moskalewski［7］等用从大鼠颅盖骨分离的成骨细胞研究自体和异体异位移植的成骨情况，将成骨细胞植入自体胫骨后肌内，3天后有小的骨岛形成，14天骨岛相互融合，56天即有硬骨块出现。但植入异体胫骨后肌的成骨细胞则未能在肌内形成骨结构，估计是与大量免疫细胞的局部浸润，免疫排斥反应太强所至。Uchida［5］为避免宿主植入部的异位间充质细胞、成纤维细胞等有成骨潜能的细胞干扰，将从人(8～12岁)骨膜分离培养的成骨细胞置入微孔滤膜扩散室(millipore diffusion chamber,MDC)然后植入成年大鼠背部皮下，4周后见有软骨和骨组织形成。值得一提的是，Uchida在实验中使用MDC这种可阻隔细胞成份而只允许小分子的营养物和代谢物自由进出的装置，不仅保证了其实验结果能充分证实MDC中的骨组织是由事先装入的人成骨细胞所形成，更重要的是，MDC在阻隔成纤维细胞和间充质细胞入室干扰的同时，同样也阻隔了淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸入，使免疫排斥反应降至很低的水平，这是他们取得异种移植成功的关键。这提示我们，只要能很好地解决免疫排斥的问题，异体甚至异种成骨细胞移植都是有可能的。稍后，Nakahara［8］等将分离培养的小鸡成骨细胞植入裸鼠皮下获得成骨，而且，将冻存的成骨细胞复苏后植入同样能够成骨。宋守礼［9］等将兔骨膜细胞培养收集，以细胞悬液形式经皮注射于自体桡骨长10 mm的骨缺损处，经X线平片和组织学检查，术后8周，大多数原骨缺损处形成骨性连接，髓腔再通，显示注入骨缺损处的成骨细胞能加速骨缺损修复。但是，应用单纯成骨细胞悬液直接回植，不论是植入骨折部还是骨缺损处，细胞都有可能因缺乏可吸附的支撑物而向四周扩散，不但植入局部的细胞浓度难以保证，而且会产生异位成骨等不利于治疗的后果；对于较长段的骨缺损，更因缺乏必要的空间形态和生物支撑作用而难以应用。因此，许多学者较早地就开展了成骨细胞与载体复合的实验研究。

　　4　成骨细胞与载体复合的体外研究

　　1992年Nolan［10］等将人成骨细胞接种到脱钙骨上继续培养，发现成骨细胞能在脱钙骨上分裂增殖并形成多层细胞覆盖脱钙骨。Vrouwervelder［11］等则研究了包括生物活性玻璃陶瓷(BGC)、羟基磷灰石(HA)、钛合金和不锈钢在内的4种较常用骨替代材料与胎鼠成骨细胞复合培养的情况，在复合培养48小时后利用扫描电镜观察细胞形态和表达。结果显示，在BGC上培养的成骨细胞表现出较好的类成骨细胞形态和较高的细胞分化率。傅荣［12］等在此基础上利用扫描电镜、3H-TDR、X-射线衍射法(X-ray diffraction,XRD)等方法进一步比较了成骨细胞在BGC、HA和双相羟基磷灰石(HA/TCP)上的生长情况，结果发现在HA/TCP上培养的成骨细胞能更好地表达成骨细胞特性。近年来，随着对可吸收性能好、毒性小的可生物降解材料的认识深入和进一步研究开发，不少学者把目光投向了聚乳酸、聚羟基乙酸等一类材料。Vacanti［13］等将取自新生牛肩胛骨的成骨细胞与聚羟基乙酸多聚纤维联合培养，7～10天即可见多聚纤维上布满增殖的成骨细胞层，说明成骨细胞很容易粘附于多聚纤维并在其上增殖。Ishang［14］等则将成骨细胞接种到聚乳酸-聚羟基乙酸的可生物降解材料上联合培养，发现成骨细胞能在材料提供的三维支架上增殖分化并形成钙盐沉积。

　　总之，可用作成骨细胞载体的生物材料种类繁多，选择余地很大。载体不仅为成骨细胞附着、生长提供支架，更重要的是能提供有利于成骨细胞增殖的良好微环境，使二者的复合体表现出良好的成骨性能。以往对人工骨材料的研究［15，16］表明，材料孔隙率30%～50%，孔径210～300μm较适宜作骨替代材料。孔隙率低，孔径太小，不利于使较多的间充质细胞和新生的骨和软骨细胞长入；孔隙率过高，孔径过大，会降低新骨形成区的强度，影响成骨效果。但作为成骨细胞载体的生物材料，其孔隙率和孔径的适宜范围是否与此一致，若有不同其适宜范围为何，目前尚缺乏相关报道。

　　5　成骨细胞与载体复合移植的实验研究

　　对成骨细胞与载体复合的在体研究几乎是与其体外研究同时进行的。1992年Nakahara［17］将等小鸡成骨细胞与多孔磷酸钙复合培养后植入裸鼠皮下，结果表明复合成骨细胞的多孔磷酸钙中骨组织形成明显增加，而且骨形成是通过早期发生于孔隙周边的膜内成骨和后期发生于孔隙中央的软骨内成骨这两种机制得以实现。实验中他们还注意到，成骨细胞形成骨和软骨结构的有效浓度为5.0×105个/ ml，低于此浓度则骨与软骨结构的形成难以保证，而低于5.0×103个/ml则不能形成骨与软骨结构。Vacanti［14］等将新生牛成骨细胞与可生物降解的多聚纤维联合培养1～2周后植入裸鼠背部皮下，6周时发现植入体主要由软骨细胞和有血管长入的外周骨岛组成，随时间进展(10周时)，植入体内新骨生长明显加速，20周时见有大块骨结构，且在有序的骨结构中发现少量的骨髓细胞，但他们未能查明这些骨髓细胞是源于供体还是宿主。Ishaug［18］等将从骨髓基质分离培养出的成骨细胞与可生物降解的聚合物泡沫联合培养7天后植入大鼠肠系膜，经组织学检查发现复合物中有钙化的骨样组织。Puelacher［19］等用类似方法培养的细胞-载体复合物修复裸鼠骨干长9 mm的骨缺损亦获得成功。姚振强［20］等取家兔骨膜成骨细胞体外扩增后，以明胶海棉为载体吸附成骨细胞回植于自体桡骨长1.5 cm的骨缺损处，经X线摄片观察12周，结果表明植入成骨细胞侧的骨形成出现时间早、生长快、质量好，明显优于只植入明胶海棉的对照侧。邹力［21］等则将同一来源的成骨细胞用酶消化法提纯并传代培养13代，然后分别与羟基磷灰石和双相磷酸钙陶瓷材料联合培养，48小时后取出复合体行异体异位植入，4周后检查发现两种复合体内均多有成骨，有钙、磷沉着，尤以双相磷酸钙陶瓷组为佳。这说明同种异体成骨细胞经酶消化法提纯并传代培养后，在其抗原性明显降低的同时仍保持着成骨能力。但他们只观察了4周，未能就这些抗原性较低的成骨细胞所形成骨组织的归转情况作进一步研究。

　　6　展望

　　随着分子生物学和生物材料学的发展，以组织工程的技术方法培养出既具有成骨细胞的成骨活性，又具有一定的空间构型和生物支撑作用、成骨效果能媲美自体骨的新型骨替代材料已非奢望。但是，目前有关的实验大部分是在非灵长类的小型动物(特别是无免疫排斥反应的裸鼠)身上进行的，如何将这些实验技术方法逐步过渡到人体并应用于骨缺损修复，尚有许多问题需要解决。例如，尽管已有将成骨细胞与载体复合修复鼠、兔节段性骨缺损获得成功的报道，但是，同比例的人骨缺损与这些动物模型显然不在一个等级上，这不仅仅是载体大小和细胞数量的问题，还涉及到载体材料的生物力学强度、培养液和气体(O2和CO2)以及细胞代谢产物对载体的渗透能力、植入后血管长入的速度和深度等一系列问题，这些都有待进一步深入研究。此外，免疫排斥、诸多生长调控因子(如BMP、bFGF、IGF等)对成骨细胞分化、增殖和成骨作用的影响等问题也还需继续研究。在载体方面，我们认为未来主要有3大研究方向：①在现有骨替代材料修复骨缺损已取得一定临床应用的宝贵经验的基础上，进一步研究它们与人成骨细胞复合培养、移植的可靠参数，使复合体的成骨效能发挥至极致，可望较早应用于临床治疗骨缺损；②对新型可生物降解聚合材料的开发及其与成骨细胞复合效果的研究，前景十分诱人。特别是近年来采用层压技术合成了具有三维立体结构的可生物降解聚合泡沫，它孔隙率高，可根据需要制备成特定形态，出现伊始就被选为多种细胞和生物因子的载体，Ishaug［14、18］等的实验证明它亦适合作成骨细胞的载体。但用于修复人骨缺损，这种泡沫材料的机械强度显然不足。因此，如何提高其机械强度或开发出新的具有类似性能又具备适宜机械强度的可生物降解聚合材料，是有待进一步探索研究的课题；③对天然细胞支架的再开发利用，这主要针对经过适当处理制备的各种无细胞的骨性支架，如冻干骨、脱钙骨、脱钙骨基质、煅烧骨等。它们具有适于成骨细胞生长的天然孔隙、良好的组织相容性和必要的生物力学强度，已作为自体骨的替代材料在临床应用多时。若在已去除异体细胞的骨性支架上培养、覆盖上具有成骨活力的自体成骨细胞或已将抗原性降至极低的同种异体成骨细胞(株)，则其移植效果可望达到或接近自体骨游离移植水平，具有极大的临床应用价值。

　　作者单位：510515　广州市　第一军医大学临床解剖学研究所

　　参考文献

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