一种新的DNA-DNA交联检测法——改良单细胞凝胶电泳法

　　 　　DNA交联是细胞内发生的严重事件，它影响DNA的正常复制功能，从而导致突变或肿瘤。多种致癌物质和抗肿瘤药物可引起DNA-DNA交联，如砷、镍、铬、顺铂、丝裂酶素C等［1～4］。因此，检测外环境因素所导致的DNA-DNA交联是判断其是否为诱变剂或致癌因素的有效手段。传统检测DNA交联物的方法是碱洗脱法，但该法昂贵、耗时、操作复杂，并涉及到同位素［5］。发展新的DNA-DNA交联物检测方法实有必要。

　　单细胞凝胶电泳法是一种公认的检测DNA链断裂的敏感、快速、简便和廉价的方法［6］。在此基础上，多位学者对其进行了改良［7，8］，试图将该法用于DNA交联物的检测。其改良的原理是在交联剂作用细胞时用DNA断裂剂作用，这样，交联剂就会减少后者所致的DNA断裂后电泳的距离和量，与未加交联剂相比，慧星尾部减少的长度等指标与交联物的量成正比。这些研究常用的DNA断裂剂是甲基甲磺酸(MMS)和γ射线。Pfuhler等［7］采用MMS作为标准DNA断裂剂，发现单细胞凝胶电泳法可以用于检测DNA-DNA交联，但其敏感性不高；Merk等［8］用γ射线作为DNA交联的标准断裂剂，结果显示该法检测DNA蛋白交联较敏感，而不适合于DNA-DNA交联的检测。

　　单细胞凝胶电泳法检测过氧化氢所致的DNA链断裂非常敏感［9］。在我们刚完成的研究中发现，1℃时过氧化氢与DNA的链断裂仍存在剂量效应关系［10］，在此条件下，既可抑制DNA的修复功能，又可使过氧化氢起到DNA标准断裂剂的作用；同时，考虑到过氧化氢极易得到，所以本研究将在1℃条件下把它作为DNA的标准断裂剂用以检测DNA-DNA交链。

　　顺铂(Cisplatin,DDP)是一种导致以DNA-DNA链内交联为主的抗肿瘤药［1］，而丝裂酶素C(Mitomycin C,MMC)则主要导致DNA-DNA链间交联［2］，本研究将以此两药物作为DNA-DNA交联物的阳性标准。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂与仪器　正常及低熔点琼脂凝胶(Promega)、DMEM培养基(Gibco)、DDP(昆明三戍贵金属药业公司)、MMC(Kyowa Hakko Kogyo)、水平电泳槽、中压电泳仪(Bio RAD)、荧光显微镜及计算机成像与分析系统(ZEISS)。

　　1.2　细胞培养与染毒　猴肾Vero细胞株由香港大学微生物学教研室惠赠。将3×105个细胞接种于25?cm2培养瓶，每种毒物6瓶，常规培养：DMEM培养基加体积分数为15%的小牛血清及100?U/ml的青霉素和链霉素，体积分数为5%的二氧化碳，37 ℃，至细胞长成80%～90%融合度时(约24?h)，分别用不同浓度的DDP和MMC染毒2?h，质量浓度为0.02%的EDTA和质量浓度为0.25%胰蛋白酶消化细胞，加5?ml预冷完全培养液中和消化液，吸入离心管，4?℃1 000?r/min，离心5?min，去上清，加预冷无菌PBS2?ml，制成细胞悬液。

　　1.3　过氧化氢处理　将上述每个剂量组的细胞悬液分成两份：A份1?ml,B份0.9?ml，后者再加0.1?ml 5?mmol的过氧化氢，混匀，全部冰浴1?h。

　　1.4　应用细胞液制备　4 ℃，1 000?r/min离心5?min，去上清，每管加150?μl PBS,悬浮细胞。

　　1.5　单细胞凝胶电泳　参照庄志雄等［10，11］的方法，每个剂量组制备4片凝胶：有过氧化氢染毒者和无其染毒者各制两片。每片胶抓取25个细胞，即每种处理样品抓取50个细胞。3次重复实验，则每种处理样品抓取150个细胞。

　　1.6　细胞存活率计数　采用常规台盼蓝细胞存活率计数法，计数200个细胞。

　　1.7　图象分析和数据处理　用KS 400 3.0逐个细胞分析，再将数据转入SPSS 8.0处理，进行卡方检验、方差分析和Pearson相关系数计算与检验。

　　2　结果

　　2.1　细胞存活率　第1次实验时，对冰浴作用后各组的细胞存活率经台盼蓝计数，结果表明：各组细胞存活率均在96%以上，经卡方检验，各剂量组间及是否有过氧化氢作用组间的细胞存活率差异均无显著性。

　　2.2　无过氧化氢作用的SCGE结果　3次重复实验结果均显示，无过氧化氢作用时，DDP和MMC的低剂量组(包括0剂量组)在镜下都只见到完整的细胞核，当DDP的浓度为500?μmol和1 000?μmol时，MMC浓度为500?μmol时，可见有轻微的拖尾现象出现(具体数据未列出)。

　　2.3　过氧化氢作用后SCGE结果　从表1可见，有关尾部的4个指标对DDP和MMC都得到了一致的结果。对DDP，其浓度为20?μmol时，对过氧化氢所致的细胞拖尾尚无显著影响，从50?μmol开始，各高剂量组的该4个指标的值均显著缩小，但100?μmol组和500?μmol组之间差异无显著性，至最大剂量组(1 000?μmol)时，肉眼已见不到明显的尾部；对MMC，其浓度为5?μmol时，各指标值无显著变化，10?μmol时即显著缩小各指标的值，随浓度的增高，影响越大，并且每组间的差异均有显著性，至最大剂量组时，同样见不到尾部。

表1　DDP和MMC对过氧化氢致DNA链断裂的影响(+s)

组别	浓度 　　(μmol/L)	尾面积(×103)	尾积分(×103)	尾长(×102)	尾矩(×108)
Cis-Platin	0	23.13±18.09	2.39±1.16	1.90±0.71	2.67±1.99
(DDP)	1	20.79±11.43	2.48±0.70	1.89±0.56	2.72±1.16
	2	14.75±12.57ab	2.00±0.85ab	1.26±0.72ab	2.14±1.43ab
	3	7.99±7.76abc	1.53±0.70abc	0.92±0.58abc	1.45±1.08abc
	4	7.46±6.22abc	1.50±0.59abc	0.90±0.55abc	1.32±0.76abc
	5	2.09±1.65abcde	0.55±0.33abcde	0.32±0.19abcde	0.26±0.20abcde
Mitomycin C
(MMC)	0	30.56±20.12	5.34±2.68	3.09±1.87	5.66±2.85
	1	29.23±18.67	4.59±2.03	3.15±2.06	5.32±2.78
	2	21.34±10.45ab	2.56±1.16ab	2.12±1.20ab	3.29±2.54ab
	3	12.83±5.78abc	1.83±0.87abc	1.15±0.76abc	2.5±1.72abc
	4	6.79±5.65abcd	1.01±0.54abcd	0.79±0.38abcd	1.17±0.57abcd
	5	1.27±1.01abcde	0.33±0.28abcde	0.25±0.14abcde	0.31±0.29abcde

　　0，1，2，3，4，5分别代表DDP浓度为0、20、50、100、500、1 000(μmol/L)和MMC浓度为0，5，10，50，100，500(μmol/L)；a：与0组比较P＜0.01；b:1组比较P＜0.01；c:与2组比较P＜0.01；d:与3组比较P＜0.01；e:与4组比较P＜0.01。3次重复实验，各剂量组共计数150个细胞。　　经Pearson相关系数的计算和显著性检验，发现该两种药物的4个指标与其浓度都呈显著的负线性相关，MMC较DDP的相关系数大，见表2。

表2　DDP和MMC浓度与各指标间的Pearson相关系数

组别	尾面积	尾积分	尾长	尾矩
DDP	-0.468	-0.597	-0.587	-0.525
MMC	-0.769	-0.756	-0.682	-0.797

　　所有相关系数均经统计学检验，其相关性都具有非常显著性

　　(P＜0.01)

　　3　讨论

　　单细胞凝胶电泳法检测DNA交联，必须利用某种DNA链断裂剂。这种断裂剂除具有稳定的导致DNA链断裂效应外，还不能影响受检细胞原有的其他特性(特别是不能有致交联功能)；为把该方法应用到实际工作中，作用的时间应是在受检物染毒之后；另外，由于完整细胞对其DNA的损伤具有很强的即时修复能力［12］，所以，这种断裂剂的作用条件必须是尽量减少其DNA修复的。从现有的这方面的少量文献来看，都采用MMS和γ射线作为这种DNA断裂剂［7，8］。Merk等［8］在交联剂作用V79细胞后，在冰浴条件下用γ线照射以抑制DNA的修复。考虑到过氧化氢是一种确认的单纯的DNA断裂剂［9］，应同样可起到MMS和γ射线的作用，并且过氧化氢廉价，一般实验室都极易得到，故我们试图将其用于这一研究。在我们的前期实验中［10］，发现过氧化氢在冰浴条件下，尽管与37 ℃条件比较，其相同剂量的DNA损伤程度明显变轻，但与DNA链断裂之间仍存在剂量效应关系，故它在冰浴条件下抑制DNA修复的同时，同样可以作为稳定的DNA链断裂剂，我们并得到了其适宜剂量是500μmol。本次的研究结果进一步表明了过氧化氢在冰浴条件下可以起到与MMS和γ射线相同的作用。

　　与碱洗脱法检测DNA-DNA交联相比，单细胞凝胶电泳法具有敏感、快速、简便和廉价等优点，况且不涉及同位素，需要的细胞量少，并可检测到单个细胞水平的DNA损伤。Zwelling等［13］用碱洗脱法在V79细胞能检测到DDP致显著DNA-DNA交联的最小剂量是10?μmol，而Hincks等［14］用该法在人上皮细胞能检测到MMC致显著DNA-DNA交联的相应剂量是20?μmol。我们经过多次预实验得到了用此法检测DDP和MMC致DNA-DNA交联的具有剂量效应关系的最小和最大剂量，DDP是50～1 000?μmol，MMC是10～500?μmol。可见，本方法检测DDP不如碱洗脱法敏感，但检测MMC的敏感性要高于后者。

　　Pfuhler等［7］用MMS在人白细胞所得到的可见显著DNA-DNA交联的最小剂量对DDP和MMC分别是330?μmol和200?μmol，Merk等［8］用γ射线在V79细胞所得到的相应结果则分别是100?μmol和10?μmol。由此可见，我们的实验方法检测DNA-DNA交联的敏感性远高于Pfuhler等的，而与Merk等的相近，况且对DDP，本法似乎比Merk等的更敏感。

　　总之，本研究为利用SCGE检测DNA-DNA交联探索出了一条迄今为止更敏感、更廉价和简便的途径。

　　本课题受国家自然科学基金(39970636)和深圳市科技计划项目资助

　　参考文献

　　［1］　Zamble DB,Lippard SJ.Cisplatin and DNA repair in cancer chemotherapy. TIBS,1995,20:435-439.

　　［2］　Tomasz M.The miomycins:natural cross-linkers of DNA.Editors:Neidle S,Waring M.Molecular aspects of anticancer drug-DNA interactions. CRC Press,1994,2:313-349.

　　［3］　Tice RR,Yager JW, Andrews P,et al.Effect of heptic methyl donor status on urinary excretion and DNA damage in B6C3F1 mice treated with sodium arsenite. Mutat Res,1997,386:315-334.

　　［4］　Refsvik T,Andreassen T.Surface binding and uptake of nickel(Ⅱ)in human epithelial kidney cells:modulation by ionomycin, nicardipine and metals.Carcinogenesis,1995,16:1107-12.

　　［5］　Takeuchi T,Morimoto K.Evaluation of genotoxicity by DNA damages. Nippon Eiseigaku Zasshi,1994,49:637-44.

　　［6］　Fairbairn DW,Olive PL,O' Neill KL. The comet assay:A comprehensive review. Mutat Res, 1995,339:37-59.

　　［7］　Pfuhler S,Wolf HU. Detection of DNA-crosslinking agents with the alkaline comet assay. Environ Mol Mutagen, 1996,27:196-201.

　　［8］　Merk O,Speit G.Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environ Mol Mutagen,1999,33:167-172.

　　［9］　Szmigiero L,Studzian K.H2O2 as a DNA fragmenting agent in the alkaline elution interstrand crosslinking and DNA-protein crosslinking assays. Anal Biochem,1988,168:88-93.

　　［10］　任泽舫，庄志雄，张锦周，等. 单细胞凝胶电泳法分析指标比较及H2O2致DNA损伤的剂量效应关系. 中华劳动卫生与职业病学杂志，2000，4：210-212.

　　［11］　Zhuang ZX,Shen Y,Shen HM, et al. DNA strand breaks and poly (ADP-ribose) polymerase activation induced by crystalline nickel subsulfide in MRC-5 lung fibroblast cells . Hum Exp Toxicol,1996,15:891-897.

　　［12］　Ali OF, Rairkar A,Young PTI.Formation and repair of 1,3-bis-(2-chloroethyl)-1-nitrosourea and cisplatin induced total genomic DNA interstrand crosslinks in human glioma cells. Cancer Biochem Biophys,1995,14:231-41.

　　［13］　Zwelling LA,Bradley MO, Sharkey NA,et al. Mutagenicity, Cytotoxicity and DNA cross linking in V79 Chinese hamster cells treated with cis- and trans=pt(Ⅱ) diamminedichloride. Mutat Res,1979,67:271-80.

　　［14］　Hincks JR,Coulombe RAJr. Rapid detection of DNA-interstrand and DNA-protein crosslinks in mammalian cells by gravity-flow alkaline elution. Environ Mol Mutagen,1989,13:211-17.