血浆中游离梭曼的电鳐乙酰胆碱酯酶抑制测定法

　　梭曼是一种对体内乙酰胆碱酯酶(AChE)有强烈抑制作用的有机磷化合物。由于梭曼毒性强且在体内降解迅速，国外目前主要通过大进样量气相色谱或气-质联用方法来检测［1，2］，其优点是：(1)灵敏度较高，如检测下限可达1.5 pg/ml血浆；(2)可以将梭曼的4个异构体分开，以便研究各异构体在体内的动力学过程。不足之处是：检测设备价格昂贵，样本的预处理过程比较繁琐，检测时间较长，不适合临床上对毒剂浓度的快速检测。基于AChE活性抑制测定有机磷毒剂浓度的文献也有报道，优点是灵敏、简便［3］。然而，该法在检测血浆中残留梭曼时是否准确可靠，以及如何处理样本及控制检测条件，还有待于进一步研究。我们以李凤珍［4］所建的微量羟胺法为基础，建立了一种灵敏、快速的梭曼检测方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验材料　Model 550酶标仪是美国BIO-RAD公司产品，TLL-C台式高速冷冻离心机由北京四环科学仪器厂生产。

　　电鳐AChE由北京毒物药物研究所郭崇志博士提供，溴化乙酰胆碱(ACh-Br)由军事医学科学院药材供应站提供，盐酸羟胺为丹东化工二厂产品，三氯化铁为北京朝阳区通惠化工厂产品，高氯酸由北京南尚乐化工厂生产，其余试剂均为分析纯。

　　电鳐AChE用1/15 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.2～7.4)按1∶300(V/V)稀释，现用现配；溴化乙酰胆碱，以pH 4.0HCl配成0.14 mol母液，冻结保存，临用前以缓冲液按1∶10稀释后置于冰浴中；2 mol/L盐酸羟胺保存于4 ℃冰箱中；碱羟胺溶液是将2 mol/L盐酸羟胺及3.5 mol NaOH在临用前以等容积混合配成：0.197 mol/L FeCl3，以0.1 mol HCl配制而成，过滤至清后室温保存；梭曼由本所二室提供，纯度约为97%，现用现配。

　　1.2　实验动物　昆明种小鼠，♀，18～22 g；大鼠，♀，180～220 g；均由军事医学科学院实验动物中心提供。

　　1.3　原理　测定经电鳐AChE水解后的剩余底物(ACh*Br)量，与ACh加入量相比，其差量代表酶活力。剩余的ACh与羟胺在碱性溶液中作用，生成乙酰羟肟酸，后者在酸性溶液中与高铁离子生成稳定的紫红色络合物，颜色强度与ACh量成正比。在一定范围内，梭曼浓度与电鳐AChE的抑制程度具有线性关系，梭曼浓度愈高，对酶的抑制力就愈强，呈色就愈深；反之，对酶的抑制则愈弱，呈色也愈浅；根据A值的变化可以求得梭曼浓度的高低。

　　1.4　实验方法

　　1.4.1　微量羟胺法测定电鳐AChE活性　样品管：将10 μl电鳐AChE取10 μl经1.4.2处理后的上清液及30 μl 1/15 mol/L 磷酸盐缓冲液在37 ℃气浴中反应10 min后，加入0.014 mol/L ACh50 μl，反应总容积100 μl，37 ℃反应30 min后加入200 μl碱羟胺终止反应，然后加入2 mol HCl200 μl混匀，最后加0.197 mol/L FeCL3300 μl显色。显色后离心1 min(1 760 g)，吸取上清液300 μl，于492 nm处比色。正常酶管：将10 μl电鳐AChE及40 μl缓冲液在37 ℃气浴中孵温10 min，其余步骤皆同样品管。非酶水解对照管加50 μl缓冲液及50 μl 0.014 mol/LACh，在37 ℃气浴中同步孵温30 min，然后加入碱羟胺，1 min后再加入酶样品，反应总容积100 μl。ACh标准管加样与非酶水解对照管相同，置于冰浴中。试剂空白管只加缓冲液。

　　已知每管中ACh加量为0.7 μmol，故电鳐AChE在37 ℃1min内水解ACh的μmol为：

　　AChE活力(μmol ACh-min-1*μl-1)=(非酶水解对照管吸光度-样品管吸光度)*0.7/标准管吸光/30/10

　　1.4.2　梭曼浓度-电鳐AChE抑制标准曲线

　　1.4.2.1　绝对标准曲线　50 μl生理盐水+10 μl高氯酸(1 mol/L)，加入50 μl不同浓度梭曼(终浓度：10-9.5～108.2 mol/L)，混匀，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，取出上清液10 μl，微量羟胺法测定酶活性，根据梭曼浓度-电鳐AChE抑制关系求出回归方程。

　　1.4.2.2　相对标准曲线　用小鼠血浆替代生理盐水，其余方法同1.4.2.1。

　　1.4.3　回收率及方法重现性评估　重复实验，并据所测得的梭曼浓度与加入梭曼浓度相比，求出回收率。

　　1.4.4　大鼠血液中梭曼残留浓度的测定　大鼠按415 μg/kg(5LD50)尾静脉注射梭曼(约0.2 ml)后15、30 s、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min分别从眼球取血50 μl，并立即加入18 μl高氯酸(1 mol/L)终止梭曼与血液中解毒酶继续反应，充分混匀后，-4 ℃离心2.5 min(10?100 g)，上清液按1∶85(V/V)稀释后取出10 μl，羟胺法测定酶活性，并根据梭曼-电鳐AChE抑制相对标准曲线换算成血液中的梭曼浓度。

　　2　结果

　　2.1　电鳐AChE浓度与活力的关系　电鳐AChE按1∶300稀释后，观察电鳐AChE用量与反应速度的相互关系。电鳐AChE稀释液在2～10 μl范围内，酶用量与活力有较好的线性关系，故将酶用量定为10 μl。经计算求得，该酶在37 ℃可分解乙酰胆碱的量1.87 nmol ACh*min-1*μl-1。

　　2.2　梭曼与电鳐AChE抑制的量-效关系　图1表明，梭曼浓度在10-9.7～10-8.0 mol/L溶液范围内，梭曼-电鳐AChE抑制具有较好的线性关系，超出该范围，梭曼对电鳐AChE的抑制作用分别趋于平台。