四氯化碳抑制大鼠肝细胞色素P450同工酶的研究

　　细胞色素P450(Cytchrome P450,CYP)，是四氯化碳(CCl4)在体内进行代谢活化的主要酶类。研究表明，CCl4的活化产物，如*CCl3等对CYP酶类本身也产生破坏作用，而不同亚型CYP对于CCl4的破坏作用表现不同的敏感性，并且可能受到不同剂量不同接触时间等因素影响［1～3］。弄清这些问题，对揭示CCl4对机体的损伤机制，及对有效地进行CCl4的防护都有一定的意义。鉴于此，本实验主要对CCl4对苯巴比妥钠(PB)诱导型CYP2B1和3-甲基胆蒽(3-MC)诱导型CYP1A1和1A2抑制作用的剂量效应和时间效应规律及亚型间的敏感性差异问题进行了探讨，还就CYP同工酶的受抑制程度与微粒体脂质过氧化水平的可能关系进行了讨论。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　受试物　CCl4，分析纯，成都试剂厂产品。

　　1.1.2　实验动物　健康SD雄性大鼠，体重(200±22)g。由广东省计划生育委员会实验动物场提供。

　　1.1.3　试剂　PB，广东侨光制药厂产品；3-MC、试卤灵(resorufin)、五氧化试卤灵、乙氧基试卤灵、NADPH等为花王公司产品。

　　1.2　方法

　　1.2.1　动物处理　分别给予大鼠30 mg/kg 3-MC橄榄油溶液一次性腹腔注射或80 mg/kg PB生理盐水溶液连续4 d腹腔注射，建立3-MC诱导模型或PB诱导模型。同时进行剂量效应实验，各设定4个组，包括橄榄油溶剂对照和100、500、1 000 μl/kg CCl4油溶液腹腔注射染毒组，于染毒6 h后处死动物。时间效应实验在PB诱导模型中进行，分染毒后6、12、24 h 3个时间段处死动物，在每个时间段设对照组和染毒组，分别给予腹腔注射橄榄油和CCl4500 μl/kg。

　　1.2.2　样品处理　将大鼠断头处死，剖腹，暴露肝脏，用质量浓度为0.9%的生理盐水从胸主动脉灌流肝至土黄色。取出肝脏，匀浆，然后按钙沉淀法制备微粒体，分装后-80 ℃贮存备用。

　　1.2.3　观察指标　CYP含量按Omura和Sato等［6］方法，测定前微粒体先经含1 mmolEDTA、体积分数为20%的甘油、质量浓度为0.5%的胆酸钠、质量浓度为0.4%Emulgen913的磷酸盐缓冲液稳定增溶，单位nmol/mg蛋白。五氧化试卤灵O-脱烷基酶活性(PROD)和乙氧基试卤灵O-脱乙基酶活性(EROD)测定分别是检测CYP2B1和1A1酶活性高特异性的方法，本次实验根据Lubet等［4］介绍的荧光分析方法进行，单位pmol*min-1*mg-1蛋白，蛋白质含量测定用Lowry法［8］。脂质过氧化丙二醛(MDA)含量按TBA法。单位nmol/mg蛋白。

　　2　结果

　　2.1　不同剂量CCl4染毒对两模型CYP含量及酶活性的影响　研究结果表明，100 μl/kg CCl4急性染毒未引起CYP的任何显著改变(P＞0.05)，而500 μl/kg CCl4和1 000　μl/kg CCl4则导致了CYP含量、PROD和EROD酶活性的明显降低(P＜0.05)，但降低的程度在两剂量组间差异无显著性(P＞0.05)，见表1。

表1　不同剂量CCl4染毒对CYP含量及酶活性的影响(±s)

CCl4

　　剂量

　　(μl/kg)
 CYP含量

　　(nmol/mg蛋白)
 CYP酶活性

　　(pmol·min-1.mg-1蛋白)
 
3-M模型 PB模型　 3-MC模型 PB模型
0 0.85±0.18
 3.44±0.68　
 9 228±382 6 074±1 190
100 0.78±0.14 2.87±0.71 8 873±1 291 5 698±1 653
500 0.58±0.14* 0.61±0.07** 6 099±145* 1 555±130**
1 000 0.51±0.01* 0.58±0.23** 5 859±894 1 319±503**

　　与各自对照组比，*P＜0.01，**P＜0.012.2　CCl4对PB诱导模型CYP抑制作用的时间效应实验　结果表明，在PB诱导模型中，CCl4急性染毒对于CYP的抑制作用在第6小时已经很显著，随处死时间延长，其抑制作用不减，到染毒后12 h对CYP抑制作用最显著，较6 h组显著降低，但到24 h呈一定回升趋势。各时间段的染毒组CYP含量及酶活性降低，与对照组比，差异均有显著性(P＜0.05,表2)。

表2　PB诱导模型不同处死时间对CYP含量及酶活性的影响(±s)

处死

　　时间

　　(h)
 CYP2B1含量

　　(nmol/mg蛋白)
 CYP2B1含量

　　(pmol·min-1.mg-1蛋白)
 
对照 500 μl/kgCCl4 对照 500 μl/kgCCl4
　6 1.54±0.12
 0.67±0.09*　*　#
 3 973±1 100
 1 467±190*　*　#
12 1.58±0.47 0.27±0.14*　* 4 532±457 　739±347
24 1.60±0.07 0.37±0.07*　* 5 459±2 476 1 796±370*　*　#

　　与各自对照组比，*P＜0.05,**P＜0.01;与12 h染毒处死组比，#P＜0.052.3　CCl4对大鼠肝脏微粒体脂质过氧化水平(MDA含量)的影响　结果表明，100 μl/kg CCl4急性染毒未引起MDA含量的显著变化，500 μl/kg CCl4和1 000 μl/kg CCl4染毒组的MDA水平与对照组比均有显著升高(P＜0.05)。不同诱导模型，相同剂量染毒组间比较，对照组间和100 μl/kg CCl4染毒组间差异无显著性，而500 μl/kg CCl4和1 000 μl/kg CCl4染毒组间的比较发现，PB诱导模型MDA水平升高比3-MC诱导模型显著(P＜0.05,表3)。

表3　不同剂量CCl4染毒对大鼠肝微粒体MDA水平的影响(nmol/mg蛋白，±s)

CCl4剂量(μl/kg) 3-MC诱导模型 PB诱导模型
0 5.86±0.69
 5.10±1.74
 
100 6.09±0.22 6.06±0.57
500 8.60±0.45* 10.30±2.71**#
1 000 9.76±2.03* 11.38±3.71**#

　　与各自对照组比，*P＜0.05,**P＜0.01;PB模型与3-MC模型对应剂量组比，#P＜0.05　　从前述结果可见，肝微粒体CYP含量、PROD和EROD酶活性均在微粒体脂质过氧化水平升高的同时降低，且脂质过氧化的强度越高，降低的程度越大。经相关分析，得出CYP含量、PROD和EROD酶活性、MDA水平均有密切的负相关关系(P＜0.05)。

　　3　讨论

　　从本次研究的剂量效应实验结果可以看到，CCl4要对3-MC诱导型CYP造成损伤是需要达到一定剂量强度的。而当剂量一旦达到一定强度，则呈现一种类似“饱和效应”的现象，剂量再增加，受损程度不再增加。在时间效应实验中CCl4对PB诱导型CYP的抑制作用随时间都有一个从不显著到显著的渐进过程，到某一时间降低到一定程度后，CYP会逐渐回升，呈时间饱和。Degawa等［2］于1987年和1993年［3］先后报道的CCl4对3-MC诱导型CYP1A1和1A2抑制作用的时间动态数据也表现与PB诱导型CYP相似的饱和现象。这些结果都在整体实验中进一步证实了Manno等在离体实验中得出的CCl4对CYP的抑制作用具有底物和时间饱和性的特点。本实验还发现，对于CCl4的破坏作用，PB诱导型CYP无论在剂量效应实验还是在时间效应实验中表现都比3-MC诱导型CYP更为敏感。

　　分析产生上述饱和现象和敏感性差异的原因，可能与CCl4在体内的生物转化机制及其活性产物攻击的CYP靶部位有关。不少学者的研究表明，CCl4获得单电子生成*CCl3的这一过程是在CYP的血红素部分进行的，而*CCl3攻击的靶部位正是其发生代谢活化的血红素集团，呈“自灭效应”(Suicide Reaction)。Manno M等［5］认为这种反应呈假一级动力学及反应速度与底物浓度呈正比，随时间延长，底物会逐渐减少，反应速度变慢，直到平衡。这可能可以解释上述饱和现象。不同亚型CYP代谢活化CCl4产生*CCl3等自由基的能力不同，对血红素集团形成的攻击也不同，可能造成不同亚型CYP所受CCl4抑制敏感的差异。Balver等学者［6］认为，敏感性差异不是来自于各亚型CYP内在的因素，而与CYP与微粒体膜的结合方式，或不同脂环境有关；如脂环境亲脂性强，CCl4就更易达到CYP的活性部位，就易选这种亚型的CYP代谢活化进而对其破坏，造成不同亚型间敏感性差异。

　　本次实验还观察到CCl4对不同亚型CYP的抑制程度与引起的脂质过氧化水平之间呈负相关关系。但是，根据目前实验结果，还不能确定是由于脂质过氧化水平升高导致了CYP受抑制程度降低，或由于CYP受抑制程度降低导致了脂质过氧化水平升高，这还需要其他实验的证实。

　　参考文献

　　［1］　Chaudhury S, Mehendale HM. Amplification of CCl4 toxicity by chlordecone: Destruction of rat Hepatic microsomal cytochrome P-450 subpopulation, J Toxicol Environ Health, 1991, 32:277-294.

　　［2］　Degawa M, Ohta A, Namiki M, et al. In vivo selection of a low spin form of cytochrome P-448 from 3-methylcholanthrene-induced rat cytochrome P-450 isozymes by carbon tetrachloride Biochem Pharmacol, 1987, 36:3315-3317.

　　［3］　Degawa M, Mikami K, Mamiki M, et al. Inhibition of the induction and activity of hepatic P-450IA1 isozymes by in vivo administration of carbon tetrachloride to rats. Biol Pharm Bull,1993,16:1248-1250.

　　［4］　Lubet RA, Mayer RT, Cameron JW, et al. Dealkylation of penotoxyresorufin:A rapid and sensitive assay for measuring induction of cytochrome P-450 by phenobarbital and other xenobiotics in the rat. Arch Biochem Biophys, 1985, 238:43-48.

　　［5］　Manno M, DeMatteis F, Laurence JK. The mechanism of the suicidal, reductive inactivation of microsomal cytochrome P-450 by carbon tetrachloride. Biochem Pharmacol,1988,37:1981-1990.

　　［6］　Balver WG, Boersma MG, Vaeger C,et al.Differential cumene hydroperoxide sensitivity of cytochrome P-450 enzymes I Al and IIB1 determined by their way & membrane incorporation, Biochimica et Biophysica Acta,1992,1117:179-187.