尿中黄曲霉毒素代谢产物的高效液相色谱测定法

 　　黄曲霉毒素(AF)是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类人类致癌物［1］ ，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一［2～4］，其中毒性和致癌性最强的为AFB1，进入机体后除形成AFM1、AFP1等外，也可被活化为AFB1-8，9-环氧化物，攻击DNA形成AFB1-N7-鸟苷(AFB-N7-GUA), 可经尿液排出，攻击蛋白质形成AFB1-白蛋白加合物而残留于血液中［5］。机体中II相代谢酶如谷胱甘肽转硫酶（GSTs）可使谷胱甘肽与AFB1-8,9-环氧化物结合，终以AFB-硫醇尿酸(AFB-NAC)的形式经尿排出［6］，许多化学物质可影响机体I相与II相代谢酶的活性，进而改变AF代谢产物的排泄类型，所以测定尿中AF不同代谢产物的排出，不仅可评价机体的暴露水平也可为研究化学预防的机制提供科学依据。过去对人体尿中AF的排出的研究主要集中在AFM1［7，8］，测定方法有薄层层析、酶联免疫及高效液相色谱法(HPLC)等［2,9］。作者在美国Johns Hopkins University公共卫生学院环境卫生系进修期间对单克隆抗体亲和层析柱结合HPLC同时检测尿中多种AF代谢产物的方法学进行了探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　试剂与材料　 AFM1、AFB1、AFP1为SIGMA公司产品，AFB-N7-GUA 和AFB-NAC为所在实验室合成。其他所用试剂均为美国可购得最高纯度级产品。HPLC检测系统为Hawlett packed 1 040 A型紫外分光（UV）检测器并联Dynmax FL-2型荧光检测器（激发波长366 nm，发射波长436 nm）。HPLC柱为C185 μm（4×250 mm）的Microsorb反相分析柱（Rainin，Inst. Co.生产）； LCQ高效液相-质谱仪（LC/MC，Thermoquest Co）。

　　1.2　方法　人体尿样的收集：样品为所在实验室与我国的两项合作研究所采样品，采自广西扶绥县和江苏启东县两肝癌高发区成年居民。尿样为连续两天清晨收集12 h的整夜尿，分装出150 ml（50 ml×3）冰冻，空运至美国，-80 ℃冰冻保存。

　　HPLC检测系统条件设置：HPLC检测系统流动相为5mmol三乙醇甲酸铵（TEAF）水溶液和无水乙醇，色谱分离采用梯度分离，25 min之内乙醇比例从体积分数为10%上升至25%，流速为1 ml/min，柱温50 ℃，检测限AFM1为10 pg，AFB-NAC和AFB1为50 pg，AFP1和AFB-N7-GUA为0.5 ng。配制标准系列进行HPLC分析，AFP1、AFB-N7-GUA按UV峰面积定量，AFM1、AFB-NAC和AFB1按荧光峰面积定量，用峰面积和标准浓度求得标准曲线。以样品色谱图对应标准物保留时间洗脱峰面积通过标准曲线定量。

　　测定方法：免疫亲和柱树脂的成分为2 B11、2F5和IIA4 B3 3种单抗的树脂混合物，比例为2∶2∶1，其制备过程见已发表文献［10～13］。免疫亲和柱对AF代谢产物结合能力、方法的回收率测定及尿中AF生物标记物的测定方法流程按图1所示。

　　尿中所测AF代谢产物的确正：收集HPLC各标准物保留时间段的洗脱液，经过浓缩柱、甲醇洗脱，高纯氩气浓缩至50 μl后，用LC/MS对AF代谢产物进行结构分析确证［6］,LC流动相为5 μmolTEAF、体积分数为100%的甲醇和体积分数为100%的乙腈，分离梯度为开始的4%乙腈/2%甲醇，25 min内上升为13%乙腈/12%甲醇。质谱仪检测范围为200～600 m/z，碰撞能为25%和30%。

　　2　结果

　　2.1　尿中黄曲霉毒素生物标记物的HPLC分离及紫外和荧光图谱　所测5种生物标记物混合标准经HPLC分离后的紫外和荧光光谱见图2，AFP1和AFB-N7-GUA的荧光较弱，而AFM1、AFB1、AFB1-NAC则适于荧光分析。

表1　单克隆抗体免疫亲和柱对不同AF代谢产物的结合能力（%）

　 AFM1 AFB1  AFP1 AFB-NAC AFB-N7-GUA 
单一100 ng  97.0±3.2a
 96.5±3.0
 97.9±2.1
 83.6±2.9
 82.6±4.4
 
单一200 ng 95.9±3.9 95.6±5.5 … … …
混合100 nga 93.5±5.7 92.2±3.1 92.8±7.8 74.9±6.7 66.7±3.8
混合200 nga 92.5±6.4 83.8±1.5 83.9±3.3 64.1±3.6 54.3±6.5

　　结合能力=过免疫亲合柱标准物的峰面积/未过柱峰面积*100%；表中数据为4～6次试验的±s；a:混合标准100 ng指5种标准物的量分别为20 ng，混合标准200 ng?指5种标准物的量分别为40　ng

　　2.2　免疫亲和层析柱对AF代谢产物结合能力　如表1所示免疫亲和层析柱对单一标准物的结合能力较强，容量为1 ml的免疫亲合柱可结合高达100～200 ng的单一AF标准，该剂量超过尿样中AF含量的100～1 000倍，进一步证明采用1 ml的免疫亲合柱测定尿中AF生物标记物是适宜的。用混合标准物时亲合柱对尿中AF结合能力依次为AFM1≈AFB1≈AFP1＞AFB1-NAC＞AFB1-N7-GUA, 说明不同的AF代谢产物之间存在竞争性结合。

　　2.3　方法回收率　方法回收率试验表明随着加标量的不同其回收率有一定的变化，尿中主要的代谢物AFM1的研究表明，500 pg以下可达到全部回收，剂量增至5～10 ng回收率尽管有所下降，但仍可达80%左右（表2），说明该方法的回收率是可以接受的。其他AF代谢物的回收率见表2。

　　2.4　人群尿样中AF代谢产物的测定　用本方法对采自广西扶绥和江苏启东的76份尿样进行了AF生物标记物的测定，如表3所示，扶绥居民尿中的AF代谢产物含量显著高于启东居民（P＜0.01）， 88.9%（24/27）的扶绥居民尿样中可检出AFM1和AFB-NAC，AFB-N7-GUA和AFP1的检出率较低，分别为37.0%（10/27, 0.390±0.141 ng/mg肌酐）和29.6%(7/27, 0.194±0.044 ng/mg肌酐)，而AFB1则未检出。启东居民尿样中AFP1、AFB-N7-GUA和AFB1未检出。

　　2.5　尿中AFM1和AFB1-NAC的确证　收集尿样HPLC分析AFM1和AFB1-NAC保留时间段的洗脱液， LC/MS图谱（未列出）可以看到质/荷比（m/z）=329.2的AFM1分子标准特征离子，碰撞反应后可以见到m/z=329.2离子失去一个CO+基团后的m/z=301.2离子，及再失去一个CO+基团的m/z=273.3离子； 另外也有m/z=492的AFB-NAC分子标准特征离子，离子碰撞反应后可见失去N-乙酰半胱氨酸后的离子m/z=329.1。

表2　尿中AFM1、AFB1、AFP1、AFB-NAC和AFB-N7-NUA测定的回收率（%）

加标量（ng） AFM1 AFB1  AFP1  AFB-NAC  AFB-N7-GUA
5  98.3±13.0
 86.4±12.1a
 94.4±8.0
 89.4±25.8
 88.6±8.6b
 
10 79.5±8.2 80.7±3.3 91.7±5.6 67.9±6.8 86.8±5.2b

　　a:表中数据为6次试验的+s，b:尿样先经OASIS去除杂质后进行测定的结果

表3　尿样中AFM1和AFB-NAC的测定结果（pg/mg肌酐）

地区 样品数 AFM1 AFB1-NAC
检出数（%） ±s（范围） 检出数（%） ±s（范围）
广西扶绥 27 24(88.9) 145.06±37.27
 24(88.9) 463.16±135.09
 
　 　 　 (4.19～599.12) 　 (25.96～2797.66)
江苏启东 49 49(100） 8.43±1.65 33(67.3) 37.43±8.35
　 　 　 (0.58～71.48) 　 (2.72～238.22)

　　3　讨论

　　以往AF的测定方法主要有薄层层析色谱法和经物理化学方法提取后进行HPLC测定，随着免疫技术的发展建立了酶联免疫法（ELISA）、放射免疫测定（RIA）［12，13］。本研究将层析色谱法和免疫学方法结合起来，应用免疫亲合层析结合HPLC荧光检测系统进行了尿中AF代谢产物测定的研究，通过免疫亲合柱可将尿中AF代谢产物进行特异性的浓缩，再通过HPLC将不同种类的生物标记物进行分离，提高了测定的灵敏度和特异性。本方法最早由Groopman实验室建立并作为人体AF生物标记物应用于人群流行病学的调查中［2,6,14～15］，但其测定多为应用单一抗体和HPLC后的紫外分光光谱法，我们将2B11、2F5和2A4B3 3种抗体树脂混合使用，其中IIA4B3抗体为新发展的对AFB-赖氨酸和AFB-N7-GUA加成物亲合力较强的单克隆抗体(未发表资料)，所用HPLC系统同时联接荧光分光光度计，使灵敏度提高达100倍并可同时测定多种代谢产物。该免疫亲合层析柱对不同的AF代谢产物的亲合力不同，且相互间存在一定的竞争，以AFM1、AFP1和AFB1的亲合力较高，另外发现尿中的杂质可影响检测的回收率，如用10　ml尿样直接过免疫亲合柱时发现AFB-N7-GUA的回收率较低，而经OASIS柱去除杂质后则回收率明显提高。

　　广西扶绥和江苏启东两肝癌高发区人群的尿样检测结果表明，启东居民尿中AFM1的检出率为100%，但含量显著低于广西扶绥县居民尿中的含量，后者 AFB-NAC的排出量也显著高于江苏启东县的居民（P＜0.01），过去这两个地区居民均以玉米为主食，据我们曾做的调查资料表明启东居民已改大米为主食，而广西扶绥居民膳食中玉米仍占较大比例（资料将在他处发表），这可能是启东居民尿中AF代谢产物排出较低的原因之一，有必要做进一步的对比研究。尿中AFB-NAC的检出是国内首次报道，Wang等［6］报道在服用吡噻硫酮的人群尿样中AFB-NAC的含量增高，本次结果表明在不服用化学预防剂的人群尿样中也可检出AFB-NAC，说明体内AF解毒与代谢活化同时存在。

　　对尿中AF代谢产物的确证过去仅靠化学衍生法与HPLC结合紫外分光光度法［11，15］，现应用液质联谱仪直接对HPLC分析中所收集的标准峰时段的洗脱液，浓缩处理后进行结构分析，具很高的可信性。对检出率较高的AFM1和AFB-NAC取得了满意的结果，证明了本方法的准确性。

　　参考文献

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