微波变性自体骨骼肌和异体神经修复面神经缺损的实验研究

　　【摘要】　目的　利用不同的桥接移植供体修复大鼠面神经缺损增强其再生。方法　用微波变性异体腓神经和微波变性自体骨骼肌作为桥

接材料修复一侧面神经下颌支缺损。植入桥接材料10周后观测大鼠面神经再生情况，采用霍乱毒素B亚单位偶联的辣根过氧化物酶

（horseradish peroxidase conjugated cholera toxin B subunit，CB-HRP）逆行示踪法、神经肌电图、Flamming染色及HE染色观察神经轴突

和髓鞘生长发育以及神经肌肉机能恢复情况。经典的自体神经移植作为对照。结果　微波变性异体腓神经组和微波变性自体骨骼肌组轴突再生

率和数量较高，与自体神经组比较差异有显著性。自体腓神经移植组髓鞘发育较好。结论　作为修复面神经缺损的桥接供体微波变性异体腓神

经和自体骨骼肌制备简便，来源充分，神经再通效果好，具有很大的临床应用潜能。

The use of muscle autograft or nerve allograft denatured by microwave for repair of gaps in rat facial nerve

GE Pingjiang, GAO Zhiqiang, CAO Keli, et al.

　　(Department of Otorhinolaryngology, PUMC Hospital CAMS and PUMC, Beijing 100730, China)

　　【Abstract】　Objective　Attempt to enhance recovery of rat facial nerve through different grafts. Methods　Rats facial

nerve mandible branch gap was repaired using different grafts,either muscle autograft or sural nerve allograft denatured by

microwave. Axonal regeneration was studied in 10th week after insertion of the denatured muscle autografts or sural nerve

allografts and compared with results found in autologous sural nerve grafts used as controls . Axonal regeneration ,

Schwanncell behavior and efficacy of nerve and muscle were quantified using CB-HRP retrograde trace , HE staining, Flamming

staining and electromyography. Results　Denatured nerve allografts and muscle autografts supported the higher rates and

volumes of axonal regeneration. Nerve allografts had the higher degree of myeline sheath developing. Conclusion　Nerve

autograft and muscle autograft denatured by microwave are convenient，source sufficient, higher efficient grafts for

repairing facial nerve gap and have potential clinical use.

　　【Key words】　Facial nerve, diseases；　 Nerve transfer；　 Muscle, skeletal； 　Never regeneration； 　Tissue

transplantation

　　颅底外科和颞骨手术的不断发展迫切要求一种面神经缺损后有效的修复方法，非神经组织自体桥接材料被广泛重视。近几年报道自身骨骼

肌桥的前途很大。Glasby等［1］ 认为变性的骨骼肌细胞能为神经轴突芽生提供低阻力的基底膜管架。选用不同的方法使骨骼肌变性，从而能

使神经再生达到更好的状况。同时，异体神经移植也从不同角度进行研究以替代经典的自体神经移植，对异体神经移植前进行预处理从而降低

其抗原性，提供较好的轴突再生环境已渐被关注。本研究通过动物实验对面神经缺损后桥接移植供体的选用进行进一步探讨。

　　材料与方法

　　1．动物分组：Wistar雄性成年大鼠21只。体重350 g左右。随机分成3组，每组7只，A 组为经典腓神经桥接面神经组，B组为微波变性骨骼

肌桥接移植组，C组为微波变性异体腓神经桥接移植组。

　　2．移植体的制备：A组：1.5%戊巴比妥钠注射液腹腔麻醉下无菌操作切开大鼠股部皮肤，分离股薄肌和股二头肌暴露坐骨神经总干及其分

支，切取一段6 mm长的腓神经备用。B组：取手术侧股薄肌，顺肌纤维方向切除10 mm×2 mm的肌条，两端固定于塑料板上，置入微波炉中（250

W）120 s，然后在手术显微镜下裁剪成6 mm×1 mm的肌桥备用。C组：取腓神经长8 mm置入微波炉中加热（250 W）120 s，取出切割成6 mm长的

移植体备用。

　　3．手术方法：用1.5%戊巴比妥钠注射液作腹腔麻醉，剃毛后暴露颊部和股部皮肤，消毒铺巾，做自头向尾的纵行切口，显露下颌支，选用

距茎乳孔1.5～2.5 cm的一段神经，造成6 mm神经缺损。A组将已预备好的长约6 mm的自体腓神经桥置于面神经缺损间，用11/0的非吸收缝线端-

端吻合。B组用制备好的微波变性肌桥用11/0非吸收线作端-端吻合修复缺损。C组亦用制备好的微波变性异体腓神经用11/0非吸收线作端-端吻

合修复缺损。将吻合好的神经埋入颊肌中，缝合包扎。

　　4．观察项目：术后10周进行。

　　肉眼形态与光镜观察：取肌桥和神经桥中段横切面及纵切面作连续石蜡切片，分别进行HE染色和Flamming髓鞘染色。

　　神经电生理测试：用美国产Egaa系统检测面神经下颌支神经肌肉传导速度和肌肉最大动作电位，电刺激点为面神经下颌支桥接移植体上近

脑端出乳突后1.5 cm左右（非手术段）及对侧相应位置，记录点为大鼠C2触须肌。信号经Egaa软件程序分析处理。

　　霍乱毒素B亚单位偶联的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase conjugated cholera toxin B subunit，CB-HRP)逆行示踪：切断面神

经颊支、颧支和颞支后，于触须C2、D2、E2、E3、E4 相对应的毛囊肌内注入1.5％CB-HRP各2 μL 。48 h后21只大鼠均作心内灌注固定，取脑

干，沿脑干长轴水平面作连续冰冻切片（片厚40 μm）四甲基联苯胺蓝染色，中性红复染，使用图像分析仪分析测量标记的面神经元数量。

　　5．统计学处理：使用EPI INFO 5.01b版统计软件作数据的方差分析，并作Duncan新法统计。

　　结果

　　实验21只大鼠均存活，最后经心内灌注固定处死。

　　一、肉眼及光镜形态学改变

　　1．自体腓神经桥接组（A组）：移植体段直径近端较粗，愈向远端愈细，未见折光横纹，吻合口无神经瘤形成。镜下见再生的神经纤维沿

纵切面曲折平行通过神经桥向远端神经生长，中间有分支向其它方向生长，横切面芽状再生轴突数量多，但直径较小，呈束状再生，束间有不

同程度纤维组织相隔，髓鞘在神经桥中成熟良好，变性较少（图1）。

　　2.微波变性自体骨骼肌桥接组（B组）：中段直径与神经干直径相近，两吻合口质地较硬。镜下见再生的神经纤维曲折平行通过肌桥向远端

神经生长。横切面见轴突束状生长，轴突间纤维细胞较A组多。髓鞘的成熟程度较A组差，处在再生时期的髓鞘较多。

　　3.微波变性异体腓神经桥接组（C组）：中段直径于神经干直径相近，两吻合口稍硬。镜下见神经轴突有较粗主束和较细分束，束间纤维细

胞较A组多。髓鞘在神经桥中成熟较A组差（图2）。

　　二、神经电生理检测

　　当电刺激面神经下颌支桥接移植体段近脑端非手术段神经时，大鼠触须肌出现最大动作电位为神经再通的电生理标志，肌电波幅越大再通

成功率越高，3组之中自体腓神经桥接组波幅最低，微波变性骨骼肌组和微波变性异体腓神经组较高(表1)。3组之间传导速度差异无显著性（表

2）。

　　表1　3组大鼠移植侧和健侧神经肌电波幅

分组  动物

　　数
 术侧波幅

　　（mV）
 健侧波幅

　　（mV）
 术侧/健侧
A组  7  0.814 6±0.319 1  　9.445 6±1.698 5 0.086 9±0.030 9 
B组  7  1.730 0±0.879 1  10.654 9±2.292 7  0.204 4±0.114 0 
C组  7  2.925 9±0.842 9  10.914 0±2.116 5  0.273 5±0.074 5 

　　注：两侧波幅比值3组之间比较F=8.509，P=0.002 8；A组和B组之间差异有显著性(q′=3.222 0，P＜0.05)；A组和C组之间差异有显著性（

q′＝5.823 1，P＜0.01）

　　表2　3组大鼠移植侧和健侧神经肌电传导速度

分组  动物

　　数
 术侧传导速度

　　(cm/ms)
 健侧传导速度

　　（cm/ms）
 术侧/健侧 
A组  7  1.478 6±0.194 4  1.987 1±0.130 2  0.746 1±0.104 6 
B组  7  1.551 4±0.169 4  2.101 4±0.100 1  0.739 3±0.086 7 
C组  7  1.448 6±0.238 3  1.937 3±0.187 0  0.751 0±0.139 1

　　注：神经肌电传导速度两侧比值3组之间差异无显著性（F＝0.019 9，P＝0.981 2）　　三、CB-HRP逆行示踪法观察再生神经元

　　CB-HRP标记的神经元数目作为神经再通的标志（图3，4），标记的神经元数量越多、与健侧的比值越大则神经再通的成功率越高（表3）。

　　表3　3组大鼠移植侧与健侧CB-HRP逆行示踪标记面

< 分组  动物

　　数
 术侧神经元数  健侧神经元数  术侧/健侧 
A组 7 　33.000 0±

　　15.231 6
 248.285 7±

　　117.546 7
 0.139 9±

　　0.058 0　
 
B组 7 119.142 9±

　　56.398 7
 374.428 6±

　　76.207 7
 0.308 8±

　　0.089 6
 
C组 7 154.000 0±

　　48.152 5
 377.428 6±

　　72.642 6
 0.405 5±

　　0.075 5
 

　　注：标记面神经核细胞数两侧比值3组间比较（F＝22.178 0，P=0.000 1），A组和B组之间 (q′=5.911 4，P＜0.01)，A组和C组之间（q′

=9.303 2，P＜0.01）差异均有显著性

　　讨论

　　一、异体去细胞结构神经移植修复神经缺损的特点及应用

　　有效、简便的异体移植材料作为修复周围神经特别是面神经缺损的供体，以替代经典的自体神经移植供体一直是人们寻找的对象，很多学

者使用新鲜异体神经作供体，或针对移植异体神经后使用环孢素等免疫抑制剂以抑制其免疫排斥反应，以及将异体神经植入前预处理降低其抗

原性，留取其基底膜结构以利再生，这些都已有不同程度的进展［2］，其中采用去细胞处理异体神经技术，如使用致冷技术将神经液氮冻干、

反复冻融或/和用放射线等处理将其细胞结构杀死，仅保留抗原性很低的基底膜结构，从而为神经再生提供一个低阻力、高特异性支架结构以利

轴突再通。其再生效果好，取材方便，处理简单，为异体移植提供了一个新的前景。目前，此类移植已部分应用于临床，并具有较好的效果［3

］。其原理主要是：神经再生需要基底膜结构和雪旺细胞，前者提供芽生轴突附着处，后者主要是清除轴突再生中移植供体中残留坏死碎片，

并分泌多种活性物质诱导、刺激和调控轴突再生以及髓鞘形成。而且两者又相互影响，前者还为后者提供附着处，并促其分裂繁殖和成熟，而

雪旺细胞可以修复损伤的基底膜［4］。对异体神经进行冻融、冻干、放射及加热等预处理后基底膜结构仍能较完整保存，而其中活性细胞被杀

死可为轴突芽生提供一个低阻力的再生通道，另外移植供体抗原性降低，这些条件均有利于神经的再生［2］。

　　二、骨骼肌作为神经缺损后再生桥接材料的特点

　　骨骼肌用作桥接神经再生的非神经组织移植材料，其优越性一直被学者们肯定。Vracko等［5］ 发现骨骼肌变性后仍残留完整的肌膜管。

Keynes等［6］ 分别在蛙和小鼠体内观察到变性骨骼肌肌膜管架可以诱导周围神经再生，再生的纤维90％都位于肌膜管内。Whitworth等［7］

研究用不同方法对骨骼肌处理后，对坐骨神经再生的桥接作用进行比较，发现微波变性的骨骼肌比恒温加热的变性骨骼肌以及冻融变性骨骼肌

有较低的抗原性和较好的神经桥接作用。我们将大鼠的股薄肌进行微波热变性，将其作为面神经下颌支再生的桥接物，并用电生理和CB-HRP逆

行示踪进行监测，结果其效果优于大鼠自体腓肠神经桥接移植体。

　　三、使用微波变性异体腓神经和自体骨骼肌移植修复面神经缺损的特点

　　面神经作为以运动神经为主要成分的周围神经，其再生成熟有形态学恢复，电生理特性和机能恢复等指标。Gulati等［8］将大鼠和家兔的

腓神经经冻融处理后作为神经桥接供体取得良好修复神经缺损的效果，认为冻融处理神经移植供体效果好、抗原性低、基底膜结构保持完整有

利于神经再生。Whitworth等［7］将大鼠自体冻融和微波变性自体骨骼肌以及60°C恒温加热自体骨骼肌条进行对比，发现对移植体进行微波变

性较冻融变性更彻底，且促进雪旺细胞再生明显。因此我们利用微波变性异体腓神经作为移植供体，进一步探讨其优越性和特点。另外，微波

变性肌桥其抗原性较弱，变性彻底均匀，对基底膜管损伤不大，故有利于神经轴突和雪旺细胞的长入［7］。手术后神经生长10周，通过观察神

经肌电波波幅和CB-HRP逆行示踪标记的面神经核细胞数，可以推测微波变性自体骨骼肌桥接组和微波变性异体腓神经桥接组较自体腓神经桥接

组通过移植体的神经纤维数要多。自体骨骼肌桥接组在生长过程中吞噬细胞需大量吞噬变性的骨骼肌肌浆和残体，然后转化为雪旺细胞再引导

轴突芽生穿过基底膜管。异体腓神经桥接组除需要吞噬大量变性的异体神经细胞碎片和残体外，还需克服异体的免疫排斥反应。而自体腓神经

桥接组神经髓鞘雪旺细胞无此过程或此过程较短，故自体腓神经桥接组再生髓鞘较自体骨骼肌桥接组和异体腓神经桥接组成熟早。尽管通过CB

-HRP逆行示踪法和神经肌电波幅检测显示异体腓神经桥接组和自体骨骼肌桥接组比自体腓神经桥接组穿过移植体的神经纤维数目多，但是，本

研究中的 3组神经肌肉传导速度差异不明显，可能是因为尽管髓鞘厚度是神经电刺激传导变快的重要因素，但是另外再通轴突的数量和粗细也

是传导速度的重要决定指标。实验结果提示，自体腓神经桥接组生长过程中芽生轴突生长时，移植段坏死的轴突及肿胀的雪旺细胞以及部分吻

合接头处对长入纤维细胞形成了较大阻力，故芽生轴突生长方向较多，有分支向其它方向生长，达到远端肌肉神经接头处的神经纤维少。但由

于移植段的神经雪旺细胞是自体活细胞故其髓鞘发育较成熟。而自体骨骼肌桥接组在变性的肌基底膜管中生长阻力较小，故生长方向同一，但

其供轴突芽生的基底膜结构缺乏特异性，故到达肌肉神经接头的神经纤维数目较自体腓神经桥接组多。同时其雪旺细胞吞噬清除肌浆及变性骨

骼肌细胞残体时需要时间过程，故其髓鞘染色呈现发育较自体腓神经桥接组稍差，更多的雪旺细胞呈现为再生时期。异体腓神经桥接组基底膜

结构可能更近似于自体神经，此点有利于雪旺细胞发育和轴突芽生附着，且阻力因为没有各种活性细胞结构形成的阻力故轴突再生较自体腓神

经桥接组为低，但其还是异体移植，具有不同程度的免疫排斥反应。如果再有充分的时间生长，其生理机能可能会更加完善，这有待进一步研

究探讨。

　　目前对生物基底膜结构桥接修复神经缺损的最佳长度说法不一，但一般认为同修复神经的直径有关，越粗的神经其修复的最大长度越长。

　　另外，自体骨骼肌桥接组和异体腓神经桥接组之间相比较，使用t检验双尾分析统计处理数据，神经肌电波幅与健侧比值两组差异无显著性

（t=1.54，P＞0.05）。CB-HRP逆行示踪法标记的神经元数目与健侧比值两组差异有显著性意义（t=2.186，P＜0.05），但从取值来看t值几乎

位于临界，故使用SAS（6.01版）ANOVA-Neuman-Keuls法验证，CB-HRP逆行示踪法标记的神经元数目与健侧的比值显示自体骨骼肌和异体神经两

组之间（总体均数差值的95％可信区间为-0.006 2～0.199 8）差异无显著性，故对这两组的比较未作讨论。

　　总之，微波变性自体骨骼肌和微波变性异体神经作为桥接面神经缺损的移植供体具有其低阻力通道、变性彻底均匀、来源充分、方便易行

等特点，它们不失是大鼠面神经缺损后移植修复的良好供体。对它们的进一步研究可为临床神经移植供体库提供理论及实验依据。