母系遗传性聋大家系全基因组扫描研究

　　【摘要】　目的　探索与母系遗传性非综合征性耳聋相关的核基因。方法　选择常染色体上365个短串联重复序列标记，应用DNA Pooling方法对一母系遗传性聋家系进行全基因组扫描。分析比较患者基因池与患者亲属基因池、家系配偶池等位基因频率的差异，对扫描所得的部分阳性位点进行连锁分析。结果　在全基因组中发现45个患者基因池某一等位基因频率远高于患者亲属基因池和家系配偶池的位点，对其中部分位点的研究未发现紧密连锁证据。结论　本文经全基因组扫描所确定的45个阳性位点可作为本家系连锁分析的候选位点。

Whole genome-wide scanning for a large pedigree with matrilineal deafness

XING Guangqian, YAN Ming, BU Xingkuan, et al.

　　(Department of Otorhinolaryngology, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

　　【Abstract】　Objective　To search responsible nuclear genes for matrilineal non-syndromic deafness. Methods　Whole genome-wide scanning was performed to analyze the 365 short tandem repeats in a deaf pedigree with maternal inheritance using DNA pooling strategy. Frequencies of allele in one patient pool were compared with that in one unaffected relative pool as well as in one normal control pool. Linkage analysis was also conducted in some positive loci. Results　Allele from 45 loci occurred more frequently in the patient pool than that in the unaffected relative pool and the control pool. No linkage was found from any candidate locus investigated. Conclusion　45 positive loci obtained from this family may be as the candidate positions for matrilineal non-syndromic deafness .

　　【Key words】　Hereditary diseases； 　Tandem repeat sequences；　 Genome，human；　 Linkage (Genetics)

　　对江苏省淮阴县遗传性聋大家系研究［1］表明，线粒体DNA（mtDNA）12SrRNA基因A1555G突变与该家系致聋有关，但耳聋表型受环境因素和核基因组的影响。为探索核基因组中与该家系非综合征性耳聋相关的基因，我们应用DNA Pooling技术对该家系进行了全基因组扫描，并对扫描获得的部分阳性位点进行了连锁分析。本文报告该研究的初步结果。

　　材料与方法

　　一、DNA Pooling样本库的建立

　　在我们研究的江苏省淮阴县方氏遗传性聋核心家系［2］中选择mtDNA突变阳性个体5例（母系亲属，患者组），父系亲属5例（同胞组），家系配偶（对照组）4例为研究对象。全部受试者抽取外周静脉血5 ml，按常规方法提取并采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增DNA。使用DNA定量仪对其浓度进行准确定量，DNA样品稀释至40 ng/μL，每个个体各取DNA样品200 μL，分别构成患者基因池、患者亲属基因池和家系配偶基因池。

　　二、短串联重复序列多态标记PCR扩增

　　选择国际联合人类连锁中心（Cooperative Human Linkage Center,CHLC）公布的人基因组中365个短串联重复序列（short tandem repeats, STR）为扫描标记，该套标记为杂合度较高（0.75～0.9）的四核苷酸和三核苷酸串联重复，标记在基因组分布的平均间隔约10 cM。全部STR为荧光标记引物，荧光标记采用万能引物法。

　　使用美国Robinson公司96孔PCR扩增板，上述3套DNA池样本为模板，365对STR标记为引物，进行PCR扩增。1对引物的PCR反应参数为94℃ 5 min预变性，94℃ 40 s，58℃ 2 min，72℃ 1 min，共5个循环，使万能引物与其配对的引物充分结合；然后94℃ 40 s，58℃ 40 s，72℃ 1.5 min，共30个循环；再72℃ 1 h，使所有引物加上碱基A。2对以上引物PCR扩增时，选择扩增片段有较大差异的引物在1个反应管内扩增，除引物和水加量与1对引物的扩增有差异外，其余条件同前。

　　三、STR标记等位基因频率分析

　　制备0.3 mm的6%聚丙烯酰胺和7.7 mmol/L尿素的变性胶板，安装到ALF DNA全自动测序仪上，加样后电泳6 h，ALFwin1.0软件自动记录电泳的激光扫描结果。使用Allelelinks软件（Pharmacia公司，美国）分析等位片段扫描峰面积和峰高度，叠加图形观察3组间的差异。根据患者基因池和两组对照池等位基因的差异，选择患者基因池中的最高出现率为标准，等位基因与其它两个池中该等位基因的出现率相比较(χ2检验)，差异有显著性的位点即可确定为定位的候选位点。

　　四、连锁分析

　　确定候选位点后，以该位点标记为引物，家系全部成员DNA为模板进行PCR扩增(反应体系和参数同二)，ALF全自动分析仪电泳（条件同上）。结果导入Allelelinks软件进行单体型分析，数据输入Cyrillic软件建立家系成员和家系构成数据库，应用Design软件建立家系文件，最后用Linkage软件（5.02版）对DNA Pooling的阳性位点进行连锁分析，计算优势对数(Lods)值。此外，本文还通过STR标记位点扩增产物的PAGE-银染方法，对已报道的常染色体显性遗传性聋参考位点DFNA2、DFNA1和DFNA3的连锁标记D1s193、D5s4110和D13s143进行了家系的连锁分析。

　　结果

　　一、全基因组扫描结果

　　应用ALF全自动测序仪和Allelelinks软件分析比较3组DNA池样品的荧光峰面积和荧光峰高度的相对差别，在本文365个位点中筛选出45个患者组某一等位基因频率远高于正常对照组的位点，从表1可见，在其中42个位点患者基因池等位基因纯合度与其他2组比较差异有显著性，表明患者组在上述位点享有共同等位基因频率显著高于同胞组和对照组。另有3个阳性位点（D4s2326，D6s1009和D18s976）虽可见荧光峰的差异，但软件未能统计出荧光峰高度和荧光峰面积，故无相应比较结果。

　　表1　STR标记阳性位点及等位基因纯合度

阳性位点

　　（cM）　　
 等位基因纯合度(%)  P值* P值**
患者组 同胞组  对照组
D1s552(37)  46
 14
 26
 ＜10-7 ＜0.01
D1s1622(49)  41  8  11  ＜10-7 ＜10-6
D1s534(156)  48  9  15  ＜10-9 ＜10-6
D1s1679(175)  40  0  0  ＜10-14 ＜10-14
D1s1589(198)  58  20  6  ＜10-7 ＜10-14
D1s518(209)  58  21  6  ＜10-7 ＜10-14
D1s1660(221) 47  20  24  10-4 ＜0.01
D1s1678(237)  31  15  0  ＜0.01  ＜10-8
D2s405(50)  72  26  15  ＜10-10 ＜10-15
D2s1384(227) 65  8  16  ＜10-16 ＜10-10
D3s2387(0)  60  18  17  ＜10-9 ＜10-9
D3s1304(26)  57  14  9  ＜10-9 ＜10-9
D3s2406(108)  50  16  0  ＜10-9 ＜10-14
D4s2361(88)  53  23  11  10-5 ＜10-9
D5s1453(123) 68  16  17  ＜10-12 ＜10-12
D5s1505(140) 35  6  9  ＜10-6 10-5
D6s474(117)  71  14  22  ＜10-15 ＜10-11
D7s2204(90)  62  13  23  ＜10-12 ＜10-8
D7s821(112)  54  21  12  ＜10-6 ＜10-14
D8s264(0)  31  0  0  ＜10-7 ＜10-7
D8s1119(101)  56  11  21  ＜10-14 ＜10-6
D8s373(170)  48  16  12  ＜10-6 ＜10-7
D9s921(8)  60  20  24  ＜10-8 ＜10-7
D9s925(19)  49  26  13  ＜0.01  ＜10-8
D9s922(69)  63  21  19  ＜10-8 ＜10-9
D9s910(92)  56  23  20  ＜10-7 ＜10-7
D11s1984(0)  50  19  21  ＜10-7 ＜10-7
D11s4464(118)  37  9  11  ＜10-6 ＜10-5
D12s372(11)  37  12  14  ＜10-4 ＜10-3
D12s1052(74) 84  21  20  ＜10-18 ＜10-18
D12s1064(85)  64  22  20  ＜10-8 ＜10-9
D12s392(169) 47  15  20  ＜10-6 10-4
D13s1493(19)  54  16  6  ＜10-7 ＜10-12
D13s894(28)  28  4  0  ＜10-6 ＜10-8
D14s2623(108) 56  10  12  ＜10-7 ＜10-12
D15s822(0)  80  13  20  ＜10-20 ＜10-17
D16s748(11)  52  8  10  ＜10-11 ＜10-10
D16s769(39)  53  11  20  ＜10-10 ＜10-6
D18s843(28)  61  18  21  ＜10-9 ＜10-8
D18s858(79)  67  21  25  ＜10-10 ＜10-9
D19s586(26)  51  23  19  ＜10-4 ＜10-5
D20s480(75)  52  19  16  ＜10-6 ＜10-6

　　注：*患者组与同胞组比较；**患者组与对照组比较

　　二、家系成员基因型确定和连锁分析结果

　　从上述DNA Pooling阳性位点中，选择连续排列有差异的9个位点及3个常染色体显性遗传性聋参考位点进行基因型和连锁分析。结果表明，在所检测的12个位点中未发现紧密连锁的证据，即Lods值＜1（表2）。

　　表2　部分阳性位点及常染色体显性遗传性聋

位点　　 不同重组分数（θ）的Lods值
0.0  0.1  0.2  0.3  0.4  0.5
D1s534 -16.72
 -1.55
 -0.40
 0.08
 0.19
 0.00
 
D1s1660  -16.72 -2.02  -0.44  0.15  0.23  0.00
D4s1623 -11.70 -1.67  -0.07  0.75  0.61  0.00
D4s2361 -5.09 -0.51 -0.11  0.45  0.33  0.00
D9s922 -9.47 -0.84  -0.06  0.15  0.09  0.00
D9s910 -6.95 -0.38  0.78  0.63  0.23  0.00
D7s821 -∞  -0.30 -0.10  0.16  0.06  0.00
D12s1300 -∞  -1.00  -0.30  0.10  0.13  0.00
D13s894 -10.00 -3.00  -1.30  -0.10  0.06  0.00
D1s193 -∞  -0.30  -0.10  0.08  0.21  0.00
D5s4100  -6.70  -1.90  -0.70  0.10  0.13  0.00
D13s143 -15.67 -2.30 -0.42  0.23  0.16  0.00

　　讨论

　　自Prezant等［3］报道阿拉伯-以色列家系以来，全世界范围内陆续发现一些母系遗传性聋家系［4,5］，虽然各国学者试图通过各种方法寻找与这些家系耳聋相关的核基因组位点，但除了Guan等［6］曾经报道的一个常染色体隐性遗传性聋基因可能与线粒体DNA A1555G突变有关外，对于核基因组基因对母系遗传性聋影响的研究迄今仍未获得新的结果。1998年Fischel-Ghodsian［7］等对一个A1555G突变致聋的母系遗传性聋大家系进行了全基因组扫描研究，其未发表的结果表明除线粒体突变外，核基因组中多个基因位点可能与耳聋症状有关，并认为母系遗传性聋是由多基因遗传决定的，线粒体突变、多个核基因和不同环境因素的影响将导致不同的表型。

　　应用DNA Pooling技术进行聋基因定位研究是近年来发展的一种新技术，其主要原理为：将家系成员分成2、3个DNA池，以STR标记为引物，PCR分别扩增各个池的DNA样品，观察并比较各池中各个不同标记中不同等位基因的出现率。该技术大大减少了全基因组扫描的工作量，使连锁分析定位基因做到有的放矢。本文应用该技术在方氏遗传性聋大家系中筛选出45个患者DNA池有某一较高等位基因频率的位点，统计分析发现其中42个位点患者DNA 池等位基因频率与患者同胞组及对照组比较差异有显著性，表明这些耳聋患者在上述位点中享有共同的等位基因。由于患者中这些等位基因都可能来自同一祖先，因此也意味着这些位点可能与患者祖先传递给后代的致病基因连锁，可确定为本家系连锁分析的候选基因。这些位点的获得为进一步定位乃至最终克隆到相关基因奠定了基础，并从侧面支持了母系遗传性聋的多基因遗传假说［7］。

　　本文对上述45个候选位点中的9个位点（设定遗传模式为常染色体显性遗传）以及3个已知的遗传性聋参考位点进行了连锁分析，但均未发现连锁信息，表明在现有研究中未找到与本家系遗传性聋有关的核基因组显性位点。对这一结果存在4种解释：其一是在该家系中的确不存在与疾病连锁的核基因位点；其二是在其它候选位点中可能有致聋相关基因存在，这有赖于今后对其余36个阳性位点的进一步研究证实；其三是可能有多个核基因存在，但每个位点的作用相对较弱，从而使计算出的Lods值均＜1；第四种可能是受目前所用连锁分析软件限制而引起的统计偏差。目前使用的计算Lods值的各种软件主要是针对常染色体遗传病，将其用于母系遗传疾病的连锁分析，将可能导致因计算准确性不够而与可能的连锁位点擦肩而过的情况。因此,为获取更为可靠的分析结果,有必要在以往研究的基础上开发一套专用于母系遗传疾病的连锁分析软件,这可能有助于进一步揭示母系遗传性聋的分子机制。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39770402）

　　参考文献

　　1，邢光前，卜行宽，严明，等. 母系遗传性聋大家系听力学调查及线粒体DNA突变分析. 中华耳鼻咽喉科杂志，2000，35: 98-101.

　　2，卜行宽, 殷明德, 曹真, 等. 常染色体显性遗传性感音性聋大家系听力学调查. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1992, 27(增刊): 40-43.

　　3，Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. Nat Genet, 1993, 4: 289-294.

　　4，Matthijs G, Claes S, Longo-Mbenza B, et al. Non-syndromic deafness associated with a mutation and a polymorphism in the mitochondrial 12S ribosomal RNA gene in a large Zairean pedigree. Eur J Hum Genet, 1996, 4: 46-51.

　　5，Estivill X, Govea N, Barcelo A, et al. Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by treatment with aminoglycosides. Am J Hum Genet, 1998, 62: 27-35.

　　6，Guan MX, Fischel-Ghodsian N, Attardi G. Biochemical evidence for nuclear gene involvement in phenotype of non-syndromic deafness associated with mitochondrial 12S rRNA mutation. Hum Mol Genet, 1996, 5: 963-971.

　　7，Fischel-Ghodsian N. Mitochondrial mutation and hearing loss: paradigm for mitochondrial genetics. Am J Hum Genet, 1998, 62: 15-19.