窒息新生猪淋巴细胞凋亡与［Ca2+］I内流的实验研究

www.cnkang.com 2007-3-24 11:31:00 中华康网

　　【摘要】　目的　探讨窒息新生儿T淋巴细胞亚群的变化是否由于淋巴细胞凋亡异常启动所致，以及缺氧缺血(HI)后［Ca2+］i内流对淋巴细胞凋亡的影响。　方法　用琼脂电泳及流式细胞术(FCM)对HI新生猪淋巴细胞凋亡及淋巴细胞内游离钙(IFCa)水平作动态定量、定性分析。　结果　HI新生猪淋巴细胞经体外培养24～72小时后，其最大凋亡率(MAR)较对照组及尼莫地平治疗组明显增加（n=15, 12, 12); (31.09±17.03)%, (5.52±6.17)%, (16.95±11.3)%; F=13.480, (P＜0.001)；日平均凋亡率(DAR)较其它两组显著增高(24.08±10.44)%, (4.05±3.57)%, (13.20±6.79)%，F=22.406，P＜0.00 1); HI后4小时，72小时活体内淋巴细胞 IFCa水平明显增加，(293±72，176±43，100±43, F=33.514　9, P＜0.000　1; 240±113, 173±55, 137±50, F=5.909, P＜0.005 9); MAR及DAR与HI后4小时活体内IFCa呈显著正相关， (r= 0.361，P=0.024；r=0.395,P=0.013)；电泳观察到的“DNA梯带”与FCM结果一致。　结论　HI新生动物外周血淋巴细胞凋亡加速；凋亡的发生与钙通道激活有关；钙通道阻滞剂的早期使用能在一定程度上抑制凋亡发生。

　　Study On Apoptosis And ［Ca2+］i Infulx In Lymphocytes Of The Neonatal Piglets Following Hypoxia-Ischemia

WANG Xiaolei, LIU Xiaoping, LIU Kai, et al. The Third Municipal Hospital of Chengdu 610031, CHINA

　　【Abstract】　Objective　To determine whether the reason for the changes of T lymphocyte subsets in the neonates following prenatal asphyxia is probably the accelerated apoptosis of lymphocytes and whether the apoptosis is correlative to the intracellular free Calcium(IFCa) level.　Methods　The 'DNA Ladder' was observed by gel electrophoresis and dynamic changes of the apoptosis ratio and IFCa level in lymphocytes were investigated via Flow Cytometry(FCM) in the neonatal piglets following hypoxia-ischemia.　Results　The max apoptosis rate (MAR) in lymphocytes (incubated for 24～72 hr in vitro) post HI was higher than control group and treatment group (n=15, 12,12,±s=31.09%±17.03%,5.52%±6.17, 16.95±11.39%, F=13.48, P＜0.000 1); the daily apoptosis ratio(DAR) was also more than the others(±s=24.08±10.44%, 4.05%±3.57%, 13.20%±6.79%, F=22.406, P＜0.00 1); there was a significant increasing IFCa fluorescent intensity on the neonatal piglets' lymphocytes in viro 4hr later and 72 hr later post-HI (±s=293±72, 176±70, 100±43, F=33.5149, P＜0.000 1; ±s=240±113, 173±55, 137±50, F=5.908 8, P=0.005 9); MAR and DAR were positively correlative to IFCa fluorescent intensity in vivo 4 hr later post HI(r=0.3614, P=0.024; r=0.3946, P=0.013); the appearance of ‘DNA Ladder’ was corresponded to hypodiploid peak observed by FCM.　Conclusion　The results suggest that there is accelerated apoptosis in lymphocytes of the neonates following prenatal asphyxia and the apoptosis is correlative to activation of Calcium channel; and that proper usage of Calcium channel blockers-Nimodipin can partially inhibit this apoptosis.

　　【Key words】　Cerebral anoxia　　Cerebral ischemia　　T-Lymphocyte subsets

　　Apoptosis　　Calciun

　　我们的早期研究［1］显示窒息新生儿T细胞亚群（CD3+、CD4+ 、CD8+T细胞)明显降低，且在短期内不能恢复。刘敬等［2］研究也发现窒息新生儿T细胞亚群变化的同时，血清IgM和C3亦明显降低，血清可溶性IL-2受体水平显著升高。窒息新生儿T淋巴细胞亚群变化及免疫功能低下是否与淋巴细胞凋亡加速有关，国内外少有文献报道。我们用缺氧缺血(HI)新生猪模型模拟新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)，以探讨淋巴细胞凋亡（apoptosis, APO)与淋巴细胞内游离钙(IFCa)水平变化,以及钙通道阻滞剂对淋巴细胞凋亡的影响，现报道如下。

　　材料和方法

　　一、对象

　　健康新生猪39只，日龄≤3天，体重530～1 010 g，雌雄不限，反应好，进食好，外观无异常。每次按同窝随机分成三组：实验组(A组)15只，治疗组(B组)12只，正常对照组(C组)12只。各组体重差异无显著性(F=1.58, P＞0.05)。

　　二、方法

　　1.随机、单盲法。

　　2. HI新生猪模型的制作：结扎新生猪左颈总动脉并将其置于封闭舱内。舱内持续低流量输入含8%氧气和92%氮气的混合气体，2小时后取出新生猪为HIE模型。

　　3. 三组动物于正常空气环境下分离脐静脉做V形切口并插管。B组用微泵静脉注射尼莫地平［(1 μg·kg－1.min－1)1 h，德国拜尔公司］［3］。A组和C组注射生理盐水5～10 ml。术后常规口服羟氨苄青霉素(100 mg·kg－1.d－1)3天。动物经处理后4、72小时分别采股动脉血测淋巴细胞IFCa，并将4小时全血在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中37℃下培养24、48、72小时后分离淋巴细胞备检。

　　4.实验方法：(1)细胞凋亡分析：首先按左连富等［4］方法制备淋巴细胞悬液，用碘化丙啶(PI, Sigma Chemical Co.)荧光染色30分钟后上FACSCan流式细胞仪分析DNA，依据DNA指数(DI)判定DNA倍体。DI= (1.0±2 ) CV为二倍体(Go/G1期); DI≠（1.0±2)CV为异倍体。计算出DNA直方图各时相分布的百分比，以亚Go期(Sub-Go)或亚二倍体细胞比例表示细胞凋亡比例(AoPF)［5］。同时提取淋巴细胞DNA，经1%琼脂糖电泳，紫外灯下照相，观察“DNA梯带”现象。(2) IFCa分析：淋巴细胞悬液加入Fluo-3(Sigma Chemical Co.)染色［6］30分钟后上流式细胞仪分析淋巴细胞平均荧光强度(FI)，用其表示IFCa相对浓度。

　　5.统计学处理：所有计量资料以均值±标准差(±s)表示，用方差分析及q检验。用Logistic软件作相关性分析。

　　结果

　　一、淋巴细胞凋亡测定

　　1. 流式细胞术(FCM)测定的淋巴细胞凋亡情况：(1) 3组动物4小时、72小时活体内淋巴细胞未显示Sub-G0峰。(2)4小时全血经体外培养24、48、72小时后三组均出现不同程度的淋巴细胞凋亡。以淋巴细胞日平均凋亡率(DAR)表示3天淋巴细胞平均凋亡率(AoPF)，以淋巴细胞最大凋亡率（MAR)表示3天内测得的最大AoPF。结果（表1)显示：三组MAR比较，F=13.480, P＜0.001；三组间两两比较，q≥9.057，P＜0.05；三组淋巴细胞DAR比较，F=22.406，P＜0.001；三组间两两比较分别，Q≥5.496, P＜0.05。

　　2. DNA电泳分析：每组的部分样本作了琼脂电泳，“DNA梯带”的出现与FCM测定结果一致。

A示A组，B示B组，C示C组

　　二、淋巴细胞IFCa水平变化

　　4、72小时三组活体内淋巴细胞IFCa平均荧光强度比较，表1显示三组在4、72小时时F=33.515，P＜0.001；F=5.909,P=0.005 9。三组间两两比较，q分别≥44.673及≥56.970，P＜0.05。

表1　三组淋巴细胞凋亡及IFCa水平变化(±s)

组别猪数(只) AOPF(%) DAR(%) MAR(%) 4 h IFCA

　　(FI)
72 h IFCA

　　(FI)

24 h 48 h 72 h
A组 15 21.02±11.73 23.08±17.70 26.73±16.01 24.08±10.44 31.09±17.03 293±72 240±113
B组 12 　9.42±6.30* 14.59±11.48 12.92±8.95* 13.20±6.79* 16.95±11.39* 100±42* 137±50*
C组 12 　2.34±3.23* 　4.93±6.74* 　3.95±3.90* 　4.05±3.57*△ 　5.52±6.17*△ 176±70*△ 173±55*

　　*B或C组与A组比较，P＜0.05；△B组与C组间比较，P＜0.05　　4小时与72小时淋巴细胞IFCa水平呈显著正相关(r=0.466, P=0.002)。

　　三、淋巴细胞凋亡与IFCa的相关性分析

　　淋巴细胞MAR、DAoR分别与4小时淋巴细胞IFCa呈显著正相关 (r分别为0.3614、0.3946，P=0.024、P=0.013)。

　　讨论

　　细胞凋亡也称细胞程序化死亡，是细胞生理性死亡的主要形式。在正常生理情况下，细胞凋亡起着维持体内自身平衡的重要作用［7］。凋亡是在某些弱或亚致死量损伤刺激下，细胞产生核酸内切酶，将DNA在核小体间剪切成180～200 bp大小的片段。凋亡细胞除形态学上的特征性改变(核固缩、边集、细胞质收缩、凋亡小体形成等)外，琼脂电泳后呈现“DNA梯带（DNA Ladder）。碘化丙啶(PI)能嵌入双链核酸(DNA和RNA)的碱基对上，将RNA消化后，PI可对DNA特异性荧光染色，在488 nm激光激发下发出620 nm的荧光，经FCM分析可见凋亡的细胞出现在直方图的亚二倍体峰位置，并与细胞的主峰Go/G1期分界清楚，可定量凋亡占整个细胞群的百分比。凋亡与细胞坏死(necrosis)有着完全不同的产生诱因、形态和生理途径。前者不引起炎症反应，而后者最后细胞膜破坏，内容物释出而发生炎症反应，电泳显示“DNA拖影(DNA smear)”。

　　许多研究证实凋亡与免疫功能低下密切相关。1998年刘恩梅等［8］首先报道了易于凋亡可能是新生儿T淋巴细胞发育不成熟的另一重要特征，其凋亡途径为Bcl-2非依赖途径，白细胞介素2对维持脐血单个核细胞生存十分重要。其他研究还发现，凋亡中DNA降解片段现象与内源性Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶活性增高相一致，这种酶可被Ca2+/Mg2+激活，而被生理浓度的Zn2+所抑制；胞浆Ca2+的升高引起凋亡还是增殖，取决于第二信号的存在与否［9］。缺氧缺血后再灌注损伤、氧自由基损伤学说及钙内流学说是新生儿HIE的主要发病机制。研究也证实兔脑缺血后脑组织Ca2+和血小板IFCa均明显增加［10］；尼莫地平能阻止Ca2+内流而有效保护神经细胞［4］。Ca2+内流是否是HI新生动物淋巴细胞凋亡的主要启动途径，国内外未见报道。Fluo-3荧光染料能与IFCa特异性结合，激光激发下发出荧光，被FCM分析后以单位细胞内荧光强度的形式在直方图上表达出来，根据荧光强度可推测IFCa水平。我们用FCM对HI新生猪淋巴细胞凋亡及IFCa水平进行动态定量分析，结果显示：

　　1. HI后4、72小时在新生猪活体内未检测到明显的淋巴细胞凋亡；推测原因可能是活体内网状内皮系统吞噬功能非常活跃，淋巴细胞一旦发生凋亡即被迅速清除，而导致难于在活体内测到大量的凋亡淋巴细胞。

　　2. 三组动物淋巴细胞经体外孵育24～72小时后，均有程度不等的凋亡出现，而HI新生猪最大凋亡率及日平均凋亡率较对照组及尼莫地平治疗组明显增加。提示HI急性期新生猪淋巴细胞凋亡机制的异常启动，是导致T淋巴细胞亚群变化及免疫功能低下的重要原因之一，同时也证实了正常新生猪淋巴细胞易于凋亡这一现象。

　　3. 窒息后4、72小时新生猪淋巴细胞IFCa明显增高，而使用钙通道阻滞剂尼莫地平后IFCa明显下降的同时，凋亡率亦明显下降，但仍高于正常对照。提示淋巴细胞离体孵育时凋亡机制已经启动，经体外孵育后出现明显凋亡；凋亡与4、72小时淋巴细胞IFCa水平呈显著正相关。提示HI新生动物淋巴细胞凋亡的启动与钙通道激活、Ca2+内流密切相关，钙通道阻滞剂的早期使用可在一定程度上抑制凋亡的发生，但Ca2+内流可能不是启动HI新生猪细胞凋亡机制的唯一途径。

　　志谢　本文经华西医科大学李炜如教授、北京酒仙桥医院虞人杰教授、中国医科大学韩玉昆教授悉心指导，特此感谢

　　本课题受四川省卫生厅及成都市卫生局科研基金资助(基金编号：97007)

　　参考文献

　　1　王晓蕾,余涛,马文浩,等. 窒息对新生儿T细胞亚群及红细胞免疫功能的影响. 新生儿科杂志, 1996,11:167-169.

　　2　刘敬, 李华, 赵莉,等. 新生儿窒息的免疫学研究. 中华儿童保健杂志, 1997,5:105-108.

　　3　蒋静, 姚裕家, 李炜如. 尼莫地平对新生猪缺氧缺血性脑损伤的防治作用. 中华儿科杂志, 1997,35:61-63.

　　4　左连富主编. 流式细胞术样品制备技术. 北京：华夏出版社, 1991.28-30.

　　5　Mccloskey TW, Oyaizu N, Coronesi M, et al. Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes. Clin Immuno Immunopathol, 1994, 71:14-8.

　　6　Panda G, Kumar NA, Manogaron PS, et al. Flow cytometric study of Changes in the intracellular free Caleium during the cell cycle. Cytometry, 1996, 24:55-63.

　　7　Duvall E, Wyllie AH. Death and the cell. Immunol Today, 1986, 7:115-9.

　　8　刘恩梅, 李成荣, 杨锡强,等. 脐血淋巴细胞凋亡及其影响因素. 中华儿科杂志, 1998,36:334-336.

　　9　David JM, Sten O, Mikael J. Cellular Singnalling in programmed cell death (apoptosis). Immunol Today, 1990, 11:120-121.

　　10　谷文萍, 杨期东, 欧阳珊. 兔脑缺血脑组织Ca2+和血小板胞浆游离Ca2+的动态变化. 中华老年医学杂志, 1997,16:303-305.