新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的研究

www.cnkang.com 2007-3-24 11:36:00 中华康网

　　【摘要】　目的　研究Bc1-2蛋白和Bax蛋白在新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)中的表达，以及与细胞凋亡的关系。　方法　将新生7日龄Wistar大鼠制成HIBD模型，应用免疫组织化学——SP法及原位缺口末端标记(TUNEL)。　结果　新生大鼠HIBD时细胞凋亡与坏死并存，但以凋亡为主。Bcl-2和Bax在正常新生大鼠脑内广泛表达(+～)；缺氧缺血(HI)后脑病变处Bcl-2免疫强度明显下降(-～+)；Bax的免疫强度也减弱，其中可见散在分布的阳性凋亡细胞；HI后Bcl-2与Bax的比例下降。　结论　Bcl-2可能抑制细胞凋亡，Bax可能诱发细胞凋亡。

　　The Study on The Expression of Bcl-2 and Bax Proteins after Hypoxic-Ischemic Brain Damage in Neonatal Rat

　SUN Guilian,HAN Yukun. Department of Pediatrics, 1st University Hospital, China Medical University, Shenyang　110001

　　【Abstract】　Objective　To assess the expression of Bcl-2 and Bax proteins in brain after hypoxic-ischemic brain damage (HIBD) as well as the relationship with apoptosis in the neonate. 　Methods　The HIBD model was produced with 7-day-old wistar rats. The expression of Bcl-2 and Bax proteins as well as the relationship with apoptosis after HIBD in the neonatal rats were determined by immunohistochem and terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labelling (TUNEL) staining.　Results　Apoptosis coexisted with necrosis after HIBD by TUNEL, but apoptosis was a major form of cell death. Bcl-2 and Bax immunostaining ranged from weak to intense(+～) in the brain of normal neonatal rat. After hypoxia-ischemia(HI),a decrease or absence in immunoreactivity for Bcl-2 in apoptotic and necrotic neurons was observed, and a decrease in immunostaining for Bax was observed in the infarcted areas.Among them, there were a few scattered strong positive apoptotic cells.　Conclusion　Overexpression of Bcl-2 protects cell from apoptosis, but Bax may function as a cell death effector protein.

　　【Key words】　Cerebral ischemia　　Cerebral anoxia　　Apoptosis

　　新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)导致的继发性神经元死亡、丢失与细胞凋亡有关。已知凋亡是一种在形态及生化特征上与坏死完全不同的形式，是一基因调节的主动过程，有许多癌基因参与，其中Bcl-2家族中的Bcl-2及Bax的研究较多，Bcl-2(称为B细胞淋巴瘤/白血病-2)是从小鼠细胞淋巴瘤中分离得到的原癌基因，Bax是1993年Oltvai等用Bcl-2基因蛋白产物特异单克隆抗体免疫沉淀等方法，从人和鼠细胞中发现的，与Bcl-2共沉淀的一种蛋白质。Bax与Bcl-2的共同特点是在羧基端附近有疏水的氨基酸组成的跨膜结构域，为整合膜蛋白，其疏水层端可插入膜而发挥其调节凋亡的作用。本研究用新生大鼠HIBD模型，采用免疫组织化学——SP法及原位缺口末端标记(TUNEL)来研究Bcl-2和Bax在缺氧缺血(HI)后脑组织中表达情况，以及与细胞凋亡的关系。

　　材料和方法

　　一、材料

　　新生7日龄Wistar大鼠，性别不限，体重12～16 g,共 100只，由本院动物实验室提供。RSS -51W型便携式数字测氧仪，上海产。自制常压缺氧舱，40 cm×50 cm×60 cm,有2个2 cm×2 cm小孔与外界相通，内有电热毯控制舱温，钠石灰吸收舱内水分和CO2；程序性细胞死亡检测试剂盒为华美生物工程公司产品，内含末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)、生物素标记的dUTP 及亲和素——辣根过氧化物酶等。Bcl-2兔IgG多抗、Bax兔IgG多抗为Santa Cruz公司产品。SP通用型试剂盒及AEC试剂盒，均购自北京中山生物技术有限公司。

　　二、方法

　　1.新生大鼠HIBD模型制备：结扎大鼠左侧颈总动脉，恢复2～4小时后置于由氮气和空气调节，测氧仪监控的常压缺氧舱内［舱温(36±1)℃，氧浓度8%］，2小时后取出。分别于HI后6、18小时1、2、3、7、14、21天各处死10只，并设单纯缺氧、单纯缺血、假手术及正常鼠各5只做对照。

　　2.TUNEL染色：经10%中性福尔马林缓冲液固定后，以视交叉、乳头体中部、大脑后缘与小脑连接处为切点，将脑冠状切成四片，常规石蜡包埋，切片，6 μm厚，分别进行苏木素-伊红(HE)染色和TUNEL染色，见Gavrieli法［1］，AEC染色，苏木素复染，试验中以右侧脑做自身对照，不加TdT或生物素标记的dUTP做阴性对照，阳性细胞为核和胞浆染成红色。

　　3.免疫组织化学——SP检测：脑组织石蜡切片，部位同前，6 μm厚，预先经微波炉抗原修复，摸索出Bcl-2和Bax抗体的最佳稀释度为1∶800，操作按说明书进行。用右脑做自身对照，不加第一抗体为阴性对照，阳性细胞为胞浆和胞核内有红色颗粒沉着。免疫强度判定：400倍光镜下计数5个视野下500个细胞中的阳性细胞数，无阳性细胞，为(-)；阳性细胞占细胞总数≤1/3，且染色强度较弱，为(+)；≤1/2，为()；≤2/3()；＞2/3，且染色较强，为()。

　　结果

　　一、TUNEL染色

　　发现HI后18小时在左脑病灶处见到阳性细胞；HI后2～3天达高峰，即有凋亡特征(胞体缩小、核固缩、核碎裂、凋亡小体形成)的阳性细胞，又有坏死特征(胞体较大，核膜及核仁不清或浅染的无凋亡小体)的阳性细胞；HI后4天坏死细胞减少或消失，但凋亡持续至少3周。凋亡的细胞多位于梗塞的边缘内带及选择性细胞死亡区，坏死的细胞多位于梗塞的中心；右侧脑及小脑、脑干、其它对照组全脑均为阴性。

　　二、免疫组织化学——SP法

　　1. Bcl-2蛋白在新生大鼠及HI后脑组织中表达情况：正常新生大鼠脑的各部位均有较强的表达()，尤其皮质的2～6层及脑干的大神经细胞免疫反应较强；Bcl-2蛋白主要分布在胞浆内，呈颗粒状、索条状，核膜有时也着色；HI后在有坏死和凋亡的部位Bcl-2免疫强度明显下降(-～+)；但海马的CA2/CA3区域散在分布有弱阳性细胞。

　　2. Bax蛋白在新生大鼠及HI后脑组织中表达情况：Bax蛋白在正常新生大鼠脑内普遍存在，各部位染色由强到弱()，强烈的免疫染色在皮质、脑干的大神经细胞及小脑的蒲肯野氏细胞；Bax蛋白主要分布在正常细胞的胞浆内，呈颗粒状、索条状，核膜有时也着色；HI后在病变部位Bax免疫强度也下降，其中可见散在分布的阳性细胞，尤其在梗塞的边缘内带阳性细胞较多，多为凋亡细胞；在凋亡细胞的胞浆及核内均有Bax蛋白分布；病变海马的CA2/CA3区域也散在分布有弱阳性细胞。

　　讨论

　　近年来许多研究表明全脑或局部脑缺血引起神经元死亡是以凋亡为主。研究细胞凋亡的方法很多，比较公认的是TUNEL及DNA电泳分析，TUNEL的机制是细胞凋亡时核酸内切酶被激活，DNA被切割为185-200 bp或其倍数的片段，暴露了新形成的DNA 3’-OH末端；TUNEL法利用TdT标记这些断裂的DNA末端，结合DNA片段的生化学特点与典型的形态学特点，此法可加强识别分散的凋亡细胞和与有浓缩染色质的其它细胞(即处于有丝分裂末端的脑细胞或多形态的白细胞)；因坏死时也有DNA的降解，所以有些坏死细胞也呈阳性，TUNEL法不能明确区别两种细胞，但可通过特异的凋亡小体从形态上加以区别。本实验通过TUNEL法证实了HIBD后脑细胞有凋亡，也有坏死，但以凋亡为主，迟发性脑细胞凋亡是加重脑损伤的一个因素。

　　分子生物学研究表明脑缺血时，脑内蛋白合成大多被抑制，但一些特殊基因发生表达，并合成相应的特殊蛋白，如癌基因蛋白、热休克蛋白等，这些基因和蛋白的激活是代表保护性应激反应还是表明神经细胞死亡，还不十分清楚。Bcl-2对凋亡调节的研究很多，Bcl-2有别于其它癌基因，没有促进细胞增殖的活性，其过度表达后可抑制由于钙超载、神经生长因子缺乏、氧自由基、兴奋性氨基酸、β-淀粉样蛋白等所致的神经细胞凋亡的发生。本研究表明Bcl-2蛋白在正常新生大鼠脑内各部位有较强的表达，Bcl-2蛋白位于线粒体、内质网及核膜上，对正常细胞的自身稳定起重要作用，与文献报道相符［2］。HI后在凋亡和坏死细胞处Bcl-2免疫强度明显下降，但海马存在不均匀分布，尤其CA2/CA3区域散在有弱阳性细胞。已知海马CA1区神经元对缺血较敏感，Bcl-2蛋白在CA1区表达很低，而CA2区神经元经受同样的缺血后存活率高，此区许多细胞在HI后都表达Bcl-2蛋白，表明Bcl-2蛋白参与缺血的耐受性和次致死性损伤神经元的存活［3］。

　　Bax免疫蛋白在新生大鼠脑内广泛存在，HI后病变处Bax免疫反应减弱，其中散在分布阳性的凋亡细胞，尤其在梗塞的边缘内带较多，表明Bax参与凋亡。Bcl-2与Bax虽是同一家族，但其作用不同，Krajewski等用免疫组化法发现Bax蛋白在小鼠脑内退变的神经元表达水平高，Bcl-2与Bax的比例在凋亡时下降［4］。本研究也发现，HI后病变处Bcl-2表达水平下降至阴性，Bax表达有阴性，也有阳性，Bcl-2与Bax的比例总的是下降的，因此，Bcl-2可能抑制凋亡，Bax可能诱发凋亡，为临床干预凋亡提供了理论依据。

　　参考文献

　　1　Gavrieli Y,Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol,1992,119:493-501.

　　2　Zhang LT, Sarafian T, Kane DJ,et al. Bcl-2 inhibits death of central neural cells induced by multiple agents. Proc Natl Cad Sci USA,1993,90:4533-4537.

　　3　Gillardon F, Lenz C,Waschke KF, et al. Altered expression of Bcl-2,Bcl-x,Bax and c-Fos colocalizes with DNA fragmentation and ischemic cell damage following middle cerebral artery occlusion in rats. Mol Brain Res,1996,40:254-260.

　　4　Krajewski S, Tanaka S, Takayama S,et al.Investigations of the subcellular distribution of the Bcl-2 oncprotein:residence in the nuclear envelope,endoplasmic reticulum, and outer mitochondrial membrance.Cancer Res,1993,53:4701-4714.

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的研究

男性婚前体检有哪些项目？