生物人工肝的研究新进展

　　临床上暴发性肝功能衰竭（ fulminant hepatic failure, FHF）十分常见，病死率高达70%～80%，其救治是亟待解决的难题[1]。由于此类患者发生肝细胞坏死及功能衰竭，依靠病因治疗及一般的内科支持治疗多不能代替肝细胞特异性功能，因此长期以来，国外着重致力于肝移植和人工肝支持疗法的研究。肝移植的疗效显著，1年的存活率已达70%。然而，肝移植对技术条件、适应征及组织相容性等要求较高，供求问题也难以解决。鉴于肾透析给肾功能衰竭患者的治疗带来的革命性变化，人们期待生物人工肝（ bioartificial liver, BL）能够给肝功能衰竭患者的治疗带来突破。

　　1生物人工肝的要求

　　bL由生物材料及合成材料组成。生物材料以培养肝细胞最为理想。培养肝细胞应用于生物人工肝必须达到两个标准，一是必须具有肝特异性功能，即要求肝细胞分化程度较高；二是必须满足患者的需求，因而要求肝细胞达到一定的数量。高分化肝细胞的来源为原代肝细胞和高分化人肝细胞系。随着细胞培养技术和细胞工程技术的发展，一些大规模的细胞工程培养技术被引入了人工肝的研究领域。

　　2生物人工肝中常用的肝细胞培养系统的研究进展

　　2.1微载体培养肝细胞系统

　　微载体培养技术最大的优点在于可增大培养面积（1g葡聚糖微载体的表面积是0.6m2）。微载体大量的表面积及面积与容量关系特征适合于在有限的培养体积内粘附培养大量的肝细胞，且使用胶原被覆的微载体培养肝细胞可延长肝细胞的寿命并维持其特异性功能。 demetrious等[2]首先报道了在2例先天性代谢性肝动物模型中移植的微载体粘附肝细胞具有肝功能辅助作用。微载体粘附肝细胞植入高胆红素 gunn大鼠和白蛋白缺乏的 nagase大鼠，结果分别产生了明显的胆红素下降和可测到的白蛋白水平，异种试验中微载体人肝细胞在动物模型中同样发挥作用。在切除90%肝产生肝衰模型中，微载体粘附肝细胞可显著提高其生存率。移植肝细胞在肝再生前提供了足够的肝辅助功能。近年， dixit等[3]发明了生物修饰的多聚羟甲基丙烯酸树脂（ hEMA）微载体，用于高密度培养肝细胞移植并在实验中保持较好的肝特异性代谢功能。所有这些均提示微载体粘附肝细胞在急性和先天性代谢性肝病中可提供肝功能支持。然而，微载体体内移植仅限于动物实验，因为没有足够的免疫抑制，肝细胞排斥仍是尚待解决的问题[4，5]。随着生物工程技术和半透膜技术的发展，微载体培养肝细胞作为组合性人工肝的生物材料已有少量临床应用的报道。 nezuil等[6]使用微载体肝细胞人工肝，治疗1例33岁乙醇性肝硬变、急性肝功能衰竭患者，疗效显著，3周后患者逐渐恢复，最后接受了肝移植治疗。

　　2.2微囊包裹肝细胞

　　微囊包裹肝细胞是将游离肝细胞植入一薄层多聚左旋赖氨酸-藻酸钙膜形成的微滴内。植入微囊内的肝细胞密度可达107/ml，具有多种肝功能。而微囊的薄层外膜具有半透膜性质，在进行微囊包裹肝细胞体内移植提供肝功能支持时，无需进行免疫抑制。

　　几种肝衰和先天性肝病模型移植的微囊肝细胞均显示具有肝代谢功能，在肝衰早、晚期均可提高生存率。对 gunn大鼠的微囊肝细胞移植表明，1次移植即可降低血胆红素[7]。近来对远期效果观察发现，微囊肝细胞6～8周功能仍能保持完善，随后开始降解，肝细胞破坏，最终微囊崩解。目前国内外尚无临床报道。

　　2.3地细胞悬液透析

　　肝细胞悬浮培养是将分离的肝细胞悬浮于培养液内，患者的血液或血浆通过一半透膜与其进行物质交换。该方法简便易行，系统内可容纳大量的肝细胞。1987年 matsumura等[8]对1例不能手术切除的肝管癌所致的梗阻性黄疸并发肝衰的患者，用 kiil平板透析器内置兔肝细胞进行透析，该装置含有醋酸纤维透析膜将患者的血液和兔肝细胞悬液隔开，每次治疗用新鲜兔肝细胞进行4～6小时的透析，经多次治疗后成功地降低了血清胆红素，并使1例 fHF的代谢性脑病恢复。这种组合性人工肝的缺点在于肝细胞是贴壁依赖型的，在悬浮培养时，其活力和功能难以长期维持，因而，需要不时更换新鲜肝细胞。

　　2.4肝细胞单层培养

　　在肝细胞培养中，使用基质如聚乙酰内脂（ poly-N-P-viny-benzyl-D-lactomide, pVLA）、胶原等，可延长肝细胞的寿命及有利于长期保持其活力和功能。 hase[9]报道在200个胶原被覆的玻璃平板上培养6×109个肝细胞，其白蛋白、尿素及糖原合成功能可维持2周，且用于无肝狗血液灌注，改善了部分凝血酶激活时间，降低了血氨，延长了生存期达65小时。 dunn等[10]在胶原三明治型培养大鼠肝细胞可保持其正常形态和白蛋白合成等肝特异功能达42天。在使用 pVLA进行肝细胞培养时， kobayashi等[11]发现 pVLA可诱导类肝样组织重建（ liver-like tissue reconstruction）。在胰岛素和 eGF的作用下， pVLA上培养的肝细胞可聚集到一起形成多层肝细胞团，且显示出长期的肝特异性功能；在扫描电镜下观察，这种多层肝细胞表面有许多小管状结构的孔洞，透视电镜下可见肝细胞中有丰富的内质网，肝细胞间有胆小管样结构的孔洞，透视电镜下可见肝细胞中有丰富的内质网，肝细胞间有胆小管样结构；如在 pVLA上混合培养肝细胞及肝非实质细胞，即使无胰岛素和 eGF的作用，也可形成上述类肝样结构，这种结构可表达分泌白蛋白和胆酸的功能达1个月之久。使用基质进行单层肝细胞培养应用于组合性人工肝的缺点在于，这种系统要很大才能容纳足够数量的肝细胞。

　　2.5球形聚集肝细胞

　　普通培养方法仅能给肝细胞提供二维生长的表面，这会限制肝细胞的功能分化和生长的调节。在体内，肝细胞是处于一种三维环境之中，细胞间的相互作用能调节细胞的生长和功能分化[12]。因此，在体外培养时，如能为肝细胞提供一个类似于体内的三维生长环境，就可促进肝细胞的生长和功能分化。 landy等[12]的研究结果表明，单个分散的肝细胞具有相互聚集的倾向性。如在普通培养皿上被覆一层蛋白烯糖类物质，则分离的肝细胞就可在蛋白烯糖的作用下，自动形成球形聚集的肝细胞。其原理是蛋白烯糖的电荷密度较高，与肝细胞表面的电荷起作用，阻止肝细胞在培养表面铺展。这种球形肝细胞应用于人工肝系统的最大问题在于大的球形聚集肝细胞中心的细胞处于不良的营养和缺氧环境，易衰老死亡。因此，若要在人工肝系统中使用尚需作进一步的改良。

　　2.6中空纤维培养系统

　　在 bL中中空纤维起两个作用，一是分离器，二是用于肝细胞粘附培养。在使用中空纤维培养肝细胞时，肝细胞种植于纤维管外表面，营养液的毛细中空纤维管内循环。这样肝细胞就可在中空纤维的外表面大量增殖，可达到107/ml的细胞密度。当细胞密度达到组合性人工肝所需的数量时，就可用患者的血液代替培养液通过中空细胞内腔，进行循环，患者血液中的毒素物质就可通过中空纤维管壁被中空纤维外表面的肝细胞所代谢。目前，对这种类型的中空纤维肝细胞生物反应器研究较多，应用效果也最好。文献报道的中空纤维培养肝细胞反应器有以下几种。

　　2.6.1.中空纤维肝细胞系统将肝细胞（原代肝细胞或肝肿瘤细胞系）在中空纤维的外腔内进行培养。 sussman等[13]在中空纤维外腔培养 c3A细胞系（来源于肝母细胞瘤，分化良好），其实验研究表明这一肝细胞反应器可为醋氨酚诱发狗的 fHF模型提供肝细胞辅助，直至肝细胞再生。初步临床应用也获得了激动人心的结果，已有6例患者在使用这种组合性人工肝功能辅助治疗后得到恢复[14]。

　　2.6.2中空纤维微载体培养肝细胞系统近年 arnaout等[15]报告了一种改良的中空纤维肝细胞反应器，他们在中空纤维外腔分别植入微载体粘附肝细胞，试验表明对 fHF和慢性先天性代谢性肝病动物模型均有肝辅助作用。在这种中空培养肝细胞系统中，他们使用的是冻存的微载体粘附肝细胞，表明了这种装置方便易行的优点。在尚未发表的有限临床研究报告中，他们采用这种人工肝辅助装置救治了10例 fHF患者，改善了患者的生存率。这种装置目前正在进行临床对照实验。

　　2.6.3中空纤维微囊肝细胞系统 Yamamoto等[16]在中空纤维内腔内种植微囊肝细胞，其动物实验表明，此种组合性人工肝系统也能改善 fHF动物模型的生存率，但未见进一步的临床应用报道。

　　2.6.4双重中空纤维系统 Dixit[17]近年提出一种新的装置，即将两种不同的中空纤维管置于同一多聚碳酸盐外壳内，其中一种由多聚砜制成，孔径2μ m，并经纤维粘连蛋白生物修饰后利于肝细胞粘附，营养液通过该管循环；另一纤维管由醋酸盐纤维素制成，截留的分子量为150～200kD，宿主动物血通过该管。理论上肝病产生的毒性代谢产物通过营养液循环清除，同时肝细胞产生的基本蛋白质和因子将顺浓度梯度到达并列的醋酸盐纤维管并进入血循环，这类似于生理条件下的肝功能，其初期研究表明这种肝细胞反应器可形成有效的特异性的肝细胞功能。目前的问题是这种中空纤维的制作技术难度较大。

　　随着肝细胞生物学和细胞培养技术以及细胞工程技术的发展，新的组合性人工肝系统有望为 fHF患者提供有效的肝功能辅助。一些组合性人工肝系统已在动物实验中取得了令人满意的效果，并开始进入初期临床试验。虽然目前的临床应用报道尚有限，但其前景是鼓舞人心的。临床对比研究和组合性人工肝系统的进一步完善，相信 bL必将为 fHF的治疗开辟新的途径。

　　作者单位：徐小平1第一军医大学附属珠江医院急诊科（广州510280）

　　庄永敬2广州海军421医院

　　参考文献

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