银杏叶制剂对缺氧性肺动脉高压的影响及其与蛋白激酶C的关系

 　　【摘要】　目的　探讨银杏叶制剂对大鼠缺氧性肺动脉高压的影响及作用机制与蛋白激酶C(PKC)的关系。方法　(1) Wistar大鼠随机分为正常对照（C）组、缺氧（H）组及银杏叶治疗（GB+H）组(200 mg·kg-1.d-1，灌胃)，每组7只，测其平均体、肺循环动脉压(mSAP、mPAP)及右心室重/（左心室重+室间隔重）［RV/（LV+S）］后，再取动物左、右肺外肺动脉（PA）干，观察对500 nmol/L PKC激动剂phorbol 12，13-dibutyrate (PDBu)的时间-效应曲线及对10～11 000 nmol/L PDBu的浓度-效应曲线，以衡量PKC的功能状态。 (2) 将18例肺叶切除患者的肺内肺动脉随机分为PDBu组、PKC 抑制剂RO318220+PDBu组及银杏苦内酯B（BN52021）+PDBu组，每组6例，作对1～25 nmol/L PDBu的浓度-效应曲线，以衡量PKC的功能状态。结果　(1) 动物实验：H组的mPAP、RV/（LV+S）均分别高于C组及GB+H组（P均＜0.05)，GB+H组的mPAP仍高于C组(P＜0.05)。在离体PA水平，H组的PKC功能状态均分别显著高于C组及GB+H组（P均＜0.05)。(2) 人体标本实验：在离体人肺内PA水平，PDBu组的PKC功能状态均分别显著高于RO318220+PDBu组及BN52021+PDBu组（P均＜0.05)。结论　银杏叶制剂有降低慢性缺氧大鼠肺动脉高压、减轻右心室肥厚之效，其作用机制至少部分与抑制PKC通道的功能有关。

The effect of ginkgo biloba on hypoxic pulmonary hypertension and the role of protein kinase C

YANG Hui， XU Yongjian， ZHANG Zhenxiang.

　　(Respiratory Department， Tongji Hospital， Tongji Medical University， Wuhan 430030，China)

　　【Abstract】　Objective　To elucidate whether the mechanism of relieving hypoxic hypertension by ginkgo biloba involves attenuation of the function of protein kinase C(PKC) signal channel. Methods　1. Wistar rats were randomly divided into control（C）, hypoxic(H) and ginkgo biloba treatment(GB+H)(200 mg·kg-1.d-1, orally) groups (n=7). Each rat was first measured mean pulmonary arterial pressure (mPAP)， mean systemic arterial pressure (mSAP) and the ratio of the weight of right ventricle to that of left ventricle plus septum ［RV/(LV+S)］, then two main pulmonary artery rings were isolated to exposed to PDBu(a specific activator of PKC) to observe the time-response curve and the dose-response curve in response to 500 nmol/L PDBu and 10～11 000 nmol/L PDBu respectively to evaluate the function of protein kinase C signal channel. 2. Intrapulmonary artery rings of human(IARH) from pneumolobectomy were randomly divided into PDBu, RO318220 (inhibitor of PKC)+PDBu and ginkgolide B(BN52021)+PDBu groups(n=6), the IARH of three groups were exposed to 1～25 nmol/L PDBu to achieve dose-response curves respectively. Results　(1) mPAP， RV/(LV+S) of the H group were greater than those of C and GB+H groups respectively (P＜0.05). mPAP of GB+H group was greater than that of C group (P＜0.05). In PA experiments， the function of protein kinase C of H group was higher than those of C and GB+H groups respectively(P＜0.05). (2) In IARH experiments， the function of protein kinase C of PDBu group was higher than those of RO318220+PDBu and BN52021+PDBu groups respectively(P＜0.05). Conclusions　Ginkgo biloba can reduce chronic hypoxic pulmonary hypertension and relieve the hypertrophy of right ventricle, which is partly related to attenuation of the function of PKC signal channel.

　　【Key words】　Ginkgo biloba；　Protein kinase C；　Hypertension， pulmonary

　　银杏叶制剂中的银杏黄酮苷和银杏苦内酯具有降低体循环血压、改善血液流变学、清除氧自由基等广泛的药理学效应［1］。蛋白激酶C（PKC）信号通道是重要的细胞内生物信号传导途径，既往研究表明，该通道在缺氧性肺血管收缩及肺血管改建两大缺氧性肺动脉高压（HPAH)发病环节中均有重要地位［2，3］。已有的研究提示，银杏叶制剂中尤以银杏苦内酯B （Ginkgolide B，BN52021）可拮抗血小板活化因子（PAF)受体［4］，从而使PAF不能与其受体结合而激活细胞内的PKC通道。目前，对银杏叶的药理研究多集中于体循环，在肺循环研究尚少，尤其是对肺动脉PKC通道功能影响的研究国内外更少。我们的实验拟观察银杏叶制剂对HPAH大鼠肺动脉压及右心室肥厚的作用，并进而探讨该制剂对人及HPAH大鼠离体肺动脉环PKC通道功能的影响，以期为阐明它对肺循环的作用及其作用机制提供实验资料。

　　材料与方法

　　一、实验药品

　　银杏叶制剂：(1) 银杏叶片：江苏扬子江药业集团生产，每片含银杏叶标准萃取物（EGb761）40 mg，其中含银杏总黄酮苷24%，银杏苦内酯6%，以30%聚乙二醇-400溶解成混悬液灌胃。(2) BN52021(美国Sigma公司)以二甲基亚砜（DMSO）溶解，浓度为20 mg/ml。PKC特异性激动剂phorbol 12，13-dibutyrate （PDBu）及抑制剂RO318220（美国Sigma公司）用DMSO溶解分装（注：以上用DMSO溶解的试剂，浴槽内的DMSO终浓度＜0.8%，经空白对照实验证实对血管张力无影响）。

　　二、实验分组

　　动物部分：Wistar雄性大鼠21 只，250～300 g，随机分为3组，每组7只。(1) 正常对照组：每日以30%聚乙二醇-400 2 ml灌胃。(2) 缺氧组：按我们以往工作的方法［5］行常压缺氧，8 h/d，共14 d，每日缺氧前以30%聚乙二醇-400 2 ml灌胃。(3) 银杏叶治疗组：银杏叶片以30%聚乙二醇-400溶解成混悬液，200 mg*kg-1*d-1灌胃后同前法缺氧，8 h/d，共14 d。

　　人体标本部分： 人体肺内肺动脉取自本院胸外科肺癌切除术标本。18例患者中男13例，女5例，年龄55～67岁，除肺部肿瘤外，血气分析、肺功能、心电图等辅助检查未发现明显异常。肺内动脉在尽量远离癌灶、肉眼无癌浸润处取材，制成直径为2.5～4 mm，长为2～3 mm的血管环，随机分为3组，每组6例。(1) PDBu组：作人肺内肺动脉环对1～25 nmol/L PDBu的浓度-效应曲线。(2) RO318220+PDBu组：以RO318220 (5 μmol/L)预孵育人肺内肺动脉环30 min后，同前作PDBu浓度-效应曲线。(3) BN52021+PDBu组：以BN52021(300 μmol/L)预孵育人肺内肺动脉环30 min后，再同前法作PDBu的浓度-效应曲线。

　　三、实验方法及观察指标

　　动物部分：(1) 整体水平：动物以20%乌拉坦（0.5 ml/100 g）腹腔注射麻醉后先按孙波等［6］方法测定体循环动脉压(mSAP)及肺循环动脉压(mPAP)，然后迅速开胸取心肺，在4 ℃ Krebs液中分离左、右肺外肺动脉干；并分别剪下右心室、左心室及室间隔，待自然干燥后以电子天平称重并计算右心室重/（左心室重+室间隔重）［RV/（LV+S）］以反映右心室肥厚程度。(2) 离体水平： 每只动物分别取左、右两段肺外肺动脉干（长2～2.5 mm，直径1.5～2 mm），作对 PDBu的时间-效应曲线及浓度-效应曲线，以衡量PKC通道的功能状态。 将两段肺动脉环分别以两端有拉钩的银丝悬于2个5 ml恒温浴槽中（其中充满Krebs液，T=37 ℃，pH=7.40，持续通入95%O2、5%CO2混合气体），拉钩一端悬于张力换能器，张力信号送入多导生理记录仪记录。肺动脉环在最适前负荷（600～700 mg）下平衡1.5 h后，观察其对5 μmol/L盐酸苯肾上腺素（PE）的反应（取反应峰值为P0），然后反复洗脱至张力回到基线后，分作如下处理：① 时间-效应曲线：浴槽中加入 500 nmol/L PDBu后保持1.5 h， 观察血管张力变化，取最大张力值P1（表示为P0%）、达P1一半时对应的时间t1/2、峰值持续时间T及在不同时间点（2、4、8、12、20、40、60、80 min）时张力值（表示为P0%）为指标。② 浓度-效应曲线：浴槽中累积加入PDBu，使其浓度在10～11 000 nmol/L范围递增（取10、50、100、1 000、5 000、11 000 nmol/L 6个点），观察血管张力变化，取达最大张力值一半时对应的浓度（EC50）为指标。

　　人体标本部分：同动物标本处理法将人体肺内肺动脉环悬于5 ml恒温浴槽中记录其张力变化。在最适前负荷（800～1 200 mg）下平衡1.5 h后，观察血管环对5 μmol/L PE的反应（峰值记为P0%）， 然后反复洗脱至张力回到基线后作如下处理：(1) PDBu组：浴槽中累积加入PDBu，使其浓度在1～25 nmol/L范围内递增（取1、2.5、5、10、25 nmol/L 5个点），观察血管张力变化。(2) RO318220+PDBu组：以5 μmol/L RO318220预孵育血管环30 min后，同PDBu组处理。(3) BN52021+PDBu组：以300 μmol/L BN52021预孵育血管环30 min后，同PDBu组处理。各组取PDBu浓度-效应曲线上在各浓度点的张力值（表示为P0%）及达最大张力值一半时对应的浓度（EC50）为指标。

　　统计学处理：数据以±s表示，组间差异的显著性检验用方差分析，两两比较用q检验。

　　结果

　　一、动物部分

　　1.mSAP、mPAP及RV/（LV+S）：缺氧组的mPAP及RV/（LV+S）均分别高于正常对照组及银杏叶治疗组（P均＜0.05），银杏叶治疗组的mPAP仍高于正常对照组（P＜0.05），三组动物mSAP比较差异无显著性（P＞0.05，表1）。

表1　三组动物mPAP、mSAP及RV/(LV+S)比较(±s)

　　注：与正常对照组比较*P＜0.05，与缺氧组比较#P＜0.05，1 mmHg=0.133 kPa　　2.PKC通道功能状态指标：（1） 时间-效应曲线：各组肺动脉环均在500 nmol/L PDBu的作用下呈时间依赖性的、缓慢增强而持久的收缩反应。缺氧组的P1、T及在各时间点时的张力值均分别高于正常对照组及银杏叶治疗组（P均＜0.05），t1/2则低于后两组（P均＜0.05，表2，图1）。（2） 浓度-效应曲线：各组肺动脉环在10～11 000 nmol/L PDBu的作用下，呈浓度依赖性收缩反应（表3）。缺氧组在各浓度点的张力值均分别高于正常对照组及银杏叶治疗组（P均＜0.05，表3），而EC50低于后两组（P均＜0.05，表2）。

图1　三组动物肺动脉环各时间点的收缩反应

表2　三组动物肺动脉环P1、t1/2、T及EC50的比较(±s)

　　注：与正常对照组比较*P＜0.05，与缺氧组比较#P＜0.05

表3　三组动物肺动脉环对10～11 000 nmol/L PDBu

　　浓度依赖性收缩反应的比较(±s)

　　注：与正常对照组比较*P＜0.05，与缺氧组比较#P＜0.05　　二、人体标本部分

　　1. PDBu组与RO318220+PDBu组比较：两组人肺内肺动脉环均在1～25 nmol/L的PDBu作用下，呈浓度依赖性收缩反应。RO318220+PDBu组在各浓度点的张力值均低于PDBu组(P均＜0.05)，RO318220可几乎完全抑制肺动脉环对PDBu的反应（6例中有3例对PDBu无反应，故EC50不能计算）（表4，图2）。

图2　三组人肺内动物各时间点的收缩反应

　　2.PDBu组与BN52021+PDBu组比较：两组人肺内肺动脉环均在1～25 nmol/L的PDBu作用下，呈浓度依赖性收缩反应。BN52021+PDBu组对1、5、10 nmol/L PDBu的收缩反应均低于PDBu组（P均＜0.05，表4，图2）；该组的EC50［（13.2±2.5） nmol/L］

表4　三组人肺动脉环对1～25 nmol/L PDBu浓度依赖性收缩反应的比较(±s)

　　注：与PDBu组比较*P＜0.05

　　高于PDBu组［（3.9±0.8） nmol/L］，差异有显著性（P＜0.05）。实验中还发现，BN52021单独孵育时可引起血管环静息张力基线下漂（资料未显示），即可引起人肺内肺动脉环一定程度的舒张。

讨论

　　银杏黄酮苷和银杏苦内酯是银杏叶主要的药理成分，具有降低体循环血压、改善血液流变学、清除氧自由基等广泛的药理学效应。本组实验对慢性缺氧大鼠予银杏叶标准萃取物（EGb761）制剂灌胃2周，发现该制剂可部分降低慢性缺氧大鼠的肺动脉高压、减轻其右心室肥厚，而对大鼠平均体循环动脉压无明显影响，与个别文献报道结果一致［7］。

　　PKC 信号通道是重要的细胞内生物信号传导途径， 对血管平滑肌的舒缩、增殖均具有重要的调节作用。慢性缺氧可致该酶活性增高、酶量增多而参与缺氧性肺血管收缩和肺血管重建过程，在HPAH发病中有重要地位。本组实验发现，银杏叶治疗组大鼠比缺氧组离体肺动脉环的PKC通道功能状态明显下调，提示银杏叶制剂降低慢性缺氧大鼠肺动脉高压、减轻右心室肥厚的药理学机制涉及抑制肺动脉平滑肌PKC通道的功能。 PKC通道被PDBu激活后，可引起人肺内肺动脉环异常增强而持久的收缩，而该酶活性被RO318220特异性阻断后，收缩反应显著降低；人肺内肺动脉环经BN52021预处理后对PKC特异性激动剂反应显著下降。表明PKC通道在人肺内肺动脉平滑肌张力调节的细胞内生物信号传导中有重要地位。

　　银杏叶制剂下调肺动脉PKC通道功能的具体机制尚不清楚。已有研究证实，银杏叶制剂中成分BN52021是天然的PAF受体特异性拮抗剂［8］而PAF受体信号传导机制属甘油二酯（DG）、三磷酸肌醇（IP3）和Ca2+的信使体系［9］。PAF与其受体结合后可激活磷酸肌醇特异性的磷脂酶C，继而催化质膜上磷脂酰肌醇水解， 产生DG和IP3，DG可迅速激活PKC，通过PKC对其底物的磷酸化而引发细胞内信号级联传递，从而产生血管平滑肌收缩、增殖等生物学效应。因此我们推测BN52021抑制肺动脉PKC通道功能的具体作用机制可能与其阻断PAF的功效有一定关系，但尚待研究证实。至于它能否通过其它机制抑制PKC通道的功能或拮抗PKC通道激活后的效应而起到一定程度的抑制HPAH的作用，亦尚有待研究。

　　志谢　承蒙同济医院胸外科陈启福、汤应雄、潘铁成和赵金平教授协助收集人肺内肺动脉标本，特致谢

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（39770341）和国家教委留学回国人员科研启动基金资助项目（97436）

参考文献

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