端粒酶及其在肺癌诊断中的应用进展

　　端粒-端粒酶假说是新近提出的肿瘤形成的新理论。端粒是真核细胞染色体末端的具有保持染色体的稳定功能的DNA-蛋白复合体，端粒酶是一种RNA依赖性的DNA聚合酶，端粒酶的激活使端粒长度得以稳定，细胞获得无限增殖能力，成为永性细胞，而获得永生性是细胞恶变的关键步骤。近年的研究表明测定肺癌各种标本的端粒酶活性不仅有助于肺癌的诊断，还可用于肺癌的恶性程度、病理分期及预后的判断。端粒酶有望成为有价值的肺癌诊断的标记物。

　　端粒（telomere）是真核细胞线形染色体末端的DNA序列，其生物学功能是保持染色体的稳定。端粒DNA是由端粒酶（telomerase）以逆转录方式合成的。端粒长度缩短及端粒酶活化是细胞获得永生和癌症发生的重要因素。因此，利用端粒酶作为肿瘤的特异性标记物用以诊断和评估预后，并通过抑制端粒酶活性来治疗肿瘤已成为肿瘤研究的新热点。本文就端粒酶的结构和功能及其有肺癌诊断方面应用的研究近况作一综述。

　　端粒酶的结构与功能简介

　　端粒是真核细胞染色体末端的一种富含鸟嘌呤的DNA-蛋白复合体，是维持染色体结构完整所必需的。端粒的DNA和多种蛋白质成分组成。人体端粒DNA由6个核苷酸重复序列TTAGGG组成。端粒可保护染色体末端不被降解，防止染色体相互融合、重组，减数分裂时维持染色体正确的配对移动，并能防止DNA复制时末端序列的丢失，提高一些物种有丝分裂时染色体分离的精确性。因此，一旦端粒功能丧失，将导致染色体末端融解，出现双着丝粒，有丝分裂不稳定和细胞死亡[1]。

　　端粒酶是一种特殊的逆转录酶，由结构RNA和蛋白组成，可调控端粒的复制，能以端粒的3’端为引物，自身的RNA组分为模板，从头合成端粒以修被细胞分裂时染色体末端（端粒）的缩短。在人体端粒酶布端粒酶RNA成分（hTR）、催化亚单位（hTERT/hEST2）和端粒相关蛋白1（TEP1）三个亚单位组成[2，3]。HTR是端粒DNA合成的模板，hTERT/hEST2是决定端粒酶活性的限速决定子，TEP1的功能尚未完全阐明，可能不仅是一个结构蛋白，还可能是介导端粒酶与其它分子相互作用的调节亚单位。

　　端粒酶与肿瘤发生

　　尽管导致肿瘤的详细过程尚未完全清楚，但已经明确肿瘤发生需要有基因异常改变的积累。新近提出了肿瘤形成的新理论，即端粒-端粒酶假说[4]，通过端粒及端粒酶，将细胞衰老与肿瘤紧密联系起来。该假说的提出主要基于以下发现：①正常体细胞随年龄的增加端粒逐渐缩短；②胚系细胞及胚胎组织端粒酶活性阳性，同时具有较长的端粒；③大部分肿瘤细胞端粒较短，端粒酶活性升高；④老年人易患肿瘤。端粒-端粒酶的激活使端粒长度得以稳定，细胞获得无限增殖能力，成为永生细胞（immortal cells），而获得永生性是细胞恶变的关键步骤。端粒酶的激活究竟是通过何种机制使细胞获得永生的呢？当抑癌基因p53和Rb发生突变或癌基因如Ha-ras激活，或细胞受到肿瘤病毒/病毒蛋白（如HPV、E6/E7、E1A/E1B、SV40T抗原和EB病毒）作用时，细胞可越过第一致死期（M1）继续分分裂，端粒长度继续缩短，最终进入第二致死期（M2）。目前对于如何越过M2期的机制知之甚少，但此阶段与端粒酶活性的表达密切相关。体外实验证明SV40T抗原、EB病毒、E6/E7以及突变的p53转染后的初级细胞可以延长寿命，培养一段时期后，大部份获得永生，继续生长。已发现E6能直接诱发死亡前细胞的低水平的端粒酶活性；突变型p53转染人乳腺上皮细胞，可以激活其端粒酶而获得永生；B淋巴细胞用EB病毒转染后可以稳定缩短的端粒和表达端粒酶活性[5，6]。从端粒-端粒酶假说可以看出，端粒酶对肿瘤研究有两方面的意义：一是端粒酶可能是恶性肿瘤的标记物，可用于诊断；二是它与肿瘤的生成的增殖有关，端粒酶可能成为肿瘤治疗的靶点。

　　最近有些研究对肿瘤形成的端粒-端粒酶理论提出了挑战。有学者通过基因操作破坏培养的癌细胞系端粒酶功能，发现一些癌细胞却具有正常甚至较长的端粒[7]。基因敲除（knock out）去掉端粒酶活性的种系鼠，仍能正常生活和生育，并能发生癌变[8]。提示真核细胞可能通过端粒酶旁路途径维持端粒的DNA复制。由此看来，细胞的永生化以及癌变的形成以端粒酶途径为主（85%~95%恶性肿瘤端粒酶活性阳性），也存在非端粒酶途径。

　　端粒酶活性的检测

　　以往检测端粒酶活性的方法繁琐，组织需求量大，所得信号弱。1994年Kim等[9]报道了以PCR为基础的端粒重复扩增法（telmeric erpeat amplification protocol,TRAP），以端粒酶合成引物作为模板用于扩增，大大改进了以往的测定方法。由于该法简单、敏感性高，有力地推动了端粒酶表达的研究。尽管测定端粒酶活性的扩增方法直接且应用相对容易，但是人们仍很关心各个实验室之间的差异。最近不少学者[10，11]对TRAP法进行了改进，包括设立内对照（internal standard），可以达到半定量或定量测定水平，并可以检测可能存在于某些组织提取物中的扩增抑制剂。此外Gelmini等[12］报道了一种新的改良的快速定量非同位素法，该法使用敏感的DNA的荧光PicoGreen染料，通过测量在端炷酶反应和PCR扩增中产生的双链DNA含量而对端粒酶含量进行定量测定，是测定端粒酶较精确、快速的方法。目前可对大多数病理标本（包括脱落细胞、针吸标本、体腔积液和手术切除标本等）进行端粒酶活性测定，还有学者报道了原位TRAP法，可对细胞内端粒酶活性进行定位测定[13]。

　　大多数正常体细胞不表达端粒酶活性，但胚系细胞以及小肠的腺腔都能检测到端粒酶活性，正常的白细胞也表达低水平的端粒酶活性，而正常的睾丸和卵巢组织却表达高水平的端粒酶活性，且源于苗勒氏管上皮的宫颈、子宫内膜以及输卵管也能检测到端粒酶活性。另外，半数的肝炎组织以及绝大多数肝硬化组织中也能检测出弱阳性的端粒酶活性[14-16]。Feng等[17]克隆了人类端类酶RNA，发现生殖细胞和肿瘤细胞表达的hTR较正常体细胞和端粒酶阳性组织高得多。端粒酶活性大多数常见的癌症，如前列腺、乳房、结房、结肠、肺和肝等癌症均可测得，其阳性率为85%～95%[4]。

　　端粒酶活性测定在肺癌诊断中的应用

　　肺癌手术标本端粒酶活性测定肺癌手术标本不受取材的限制，能较客观地反映肺癌组织端粒酶的活性情况。Hiyama等[18]用TRAP法测定了136例原发性肺癌的手术切除标本癌组织端粒酶活性，其阳性率80.1%(109/136),而正常邻近组织标本的端粒酶活性阳性率仅为4.4%（3/68）。小细胞肺癌端粒酶活性均为阳性（11/11），非小细胞肺癌的端粒酶活性呈高水平见于有肺癌转移破坏者。Albanell等[19]也测定了99例非小细胞肺癌手术标本，其阳性率为85%（84/99），特异性为100%。由此可见，端粒酶测不出或活性很低的非小细胞肺癌可能含有非永生性癌细胞，而高活性的小细胞肺癌可能主要含有永生细胞。由于肺癌标本有很高的端粒酶阳性率和特异性，故测定端粒酶活性可以作为肺癌诊断的标记物。此外，测定切缘肺组织或淋巴结的端粒酶活性可能有助于判断癌组织是否切除彻底。

　　肺癌支气管冲洗液端粒酶活性测定 肺癌支气管冲洗液是经纤维支气管镜比较容易获得的标本，通常用于细胞学检测，但往往阳性率比较低。Arai等[20]用TRAP法测定了肺癌病人支气管肺泡灌洗液的端粒酶活性，37例中29例（79%）阳性，而细胞学仅24例（67%）阳性。细胞学和端粒酶联合检测其阳性率高达89%，表明支气管肺泡灌洗液端粒酶测定尤其是结合细胞学检测有很好的应用价值。最近Yahata等[21]联合应用以细胞抽提为基础的TRAP法和用于测定细胞内端粒酶活性的原位TRAP法检测支气管冲洗液标本的端粒酶活性，对肺癌诊断的阳性率为82%（18/22），而用同样的标本进行细胞学检查阳性率仅为41%，两者有显著性差异（P＜0.01）。因此，联合庆用支气管冲洗液标本的端粒酶活性检测与细胞学检查，可大大增加对肺癌诊断的可靠性。

　　肺癌胸水标本端粒酶活性测定肺癌和结核性胸膜炎均常出现胸腔积液，有时两者的鉴别较困难，有必要寻找更为可靠的诊断方法。Hiyama等[18]用TRAP法测定了3例肺癌病人的胸水端粒酶活性，结果均为阳性，最近Yang等[22]测定了144例胸腔积液病人胸液端粒酶活性，结果显示70例恶性胸水中64例阳性，52例非恶性胸水中仅3例阳性，22例未经证实而疑为恶性胸水的病人中有20例阳性，端粒酶活性测定对恶性胸水诊断的敏感性为91.4%,特异性为94.2%，阳性和阴性预计值分别为0.96、0.89。提示端粒酶活性测定可作为胸腔生活会液有效的诊断和鉴别诊断的辅助方法。

　　肺癌纤维支气管镜活检标本端粒酶活性测定 经纤维支气管镜活检是肺癌诊断的重要手段，因其创伤小、安全、可靠，被广泛应用于临床。但目前尚未见纤维支气管镜活检标本端粒酶活性测定的报道。根据对端粒酶的认识，推测用纤维支气管镜活检标本本端粒酶活性测定结合其组织学检查有可能有效地提高肺癌诊断的阳性率和可靠性。

　　肺癌针吸标本端粒酶活性测定 针吸细胞学是一种创伤小、简单易行的诊断方法，对于靠近胸壁的肺部肿块有较高的诊断价值，但是单凭细胞学其诊断的准确性和可靠性有限。Sugino等[23]测定了乳腺针吸标本的端粒酶活性，发现15例细胞学阳性的乳腺癌中10例端粒酶活性测定阳性，而29例良性乳腺病变中26例端粒酶活性测定阴性。Aogi等[24]也发现组织学肯定为甲状腺恶性肿瘤者的针吸标本有83.3%（5/6）端粒酶活性阳性，良性肿瘤仅8.3%阳性，表明针吸标本端粒酶活性测定对良、恶性肿瘤的判断有较高的实用价值。尽管目前尚未见关于肺癌针吸标本端粒酶活性测定的报道，预测可能有较好的诊断价值，有待进一步研究证实。

　　端粒酶活性测定对判断肺癌恶性程度和病理分期的价值 albanell等[19]的研究表明，端粒酶活性水平与非小细胞肺癌肿瘤TNM分期、淋巴结转移、病理分期、K-67免疫染色（肿瘤细胞增殖的指标）呈显著正相关，与病人的年龄呈负相关。Yashima等[25]发现，除了类癌样瘤和坏死的鳞状细胞癌的角化部位），大支气管基底膜上皮细胞组织学正常者26%呈弱阳性，有增生者71%呈弱阳性，23%外周肺标本呈弱阳性，上皮进一步的病理演变（化生、非典型增生和原位癌）与端粒酶的失调有关。由此可见端粒酶活性测定对判断肺癌的恶性程度和病理分期有重要的价值。

　　端粒酶对肺癌淋巴结转移的诊断价值淋巴结是肺癌常见的转移部位，明确淋巴结是否有转移对于制定治疗方案很有帮助。Yashima等[26]研究发现，组织学阴性的淋巴结96%表达低水平的端粒酶活性（均值3.0U/ug蛋白），可能是由于激活的淋巴细胞表达了端粒酶活性；所有的恶性淋巴结构均表达较高水平端粒酶活性（均值17.8U/ug蛋白），两组差异有显著性。此外，转移性癌细胞原位hTR表达相对较高，继发性滤泡发生中心hTR表达较低。由此可见，尽管激活的淋巴细胞端粒酶的表达限制了其应用，端粒酶活性的测定结合原位杂交法测定hTR仍有助于淋巴结的组织病理学诊断。

　　结 语

　　现已证实端粒酶在肿瘤发生发展中起着重要的作用，现有的研究结果初步显示，端粒酶活性测定对于肺癌的诊断有良好的应用前景。但是有些问题仍需解决：所用的端粒酶活性测定方法费用偏高，操作过于繁复，设备要求也较高，不利于临床推广应用；目前文献报道所用方法多为定性或半定量测定，容易受一些具有弱阳性表达的细胞如支气管基底膜上皮细胞、淋巴细胞等的影响而可能出现假阳性，开发更简便易行的端粒酶定量测定方法，便于区分不同程度上皮病理变化（化生、非典型增生和原位癌）和肺癌之间的界限；对各种不同的标本，尤其是便于获取的标本如痰液、胸水进行大系列的研究，将进一步提高端粒酶活性对肺癌的诊断价值。

参 考 文 献

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