胰高血糖素受体基因的第2外显子变异

　　2型糖尿病是一种具有多基因遗传背景的多因子疾病。据报道，在某些人种中，胰高血糖素受体（GCG-R）基因40号密码子的错义突变（Gly40Ser）与2型糖尿病显著相关［1］，我们同时应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性分析（PCR-RFLP）和聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术就此变异进行检测，意在探讨本地区汉族人2型糖尿病与GCG-R基因Gly40Ser突变是否存在关联。

　　一、材料和方法

　　1.对象：无亲缘关系的昆明地区汉族人200名，其中2型糖尿病患者120例（男47例，女73例）；健康对照者80名（男32名，女48名）。

　　2.模板准备：采用酚-氯仿法自人血白细胞提取DNA为模板［2］。

　　3.PCR-RFLP：上游引物为5′-TGTCTGGTTGCTTGTGCATG-3′，下游引物为5′-GAAGAGAACTCAGGAAGTGC-3′［1］，按文献进行PCR反应［3］。扩增产物与限制性内切酶Bst E Ⅱ（Promega，美国）进行酶解反应。消化产物以2%的琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后，用紫外检测系统观察结果。

　　4.PCR-DGGE：在上述上游引物的5′端加上40个只含GC碱基的片段(GC-clamp)，按参考文献［3］确定的PCR实验条件，扩增出含有GC-clamp的GCG-R基因的第2外显子。然后在Fischman报告［4］的基础上，按参考文献［5］对研究对象的GCG-R基因第2外显子进行DGGE。

　　二、结果

　　1.PCR－RFLP结果：所有研究对象PCR产物经Bst E Ⅱ酶酶解后呈现88 bp和108 bp 2个片段，表明存在Bst EⅡ酶切位点。即本组全部被检查者的GCG-R基因40号密码子基因型均表现为Gly40/Gly40。Gly40及Ser40等位基因频率均分别为1和0。基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

　　2.PCR-DGGE结果：本组全部被检者电泳区带均一致，未见异常泳动片段（图1），表明无一例存在突变。

　　3.与国外其他人种资料（方法均为PCR－RFLP）比较分析可见，本组中国人2型糖尿病患者仅与法国人(χ2=4.23，P＜0.05)和撒丁岛人(χ2=8.17，P＜0.01)2型糖尿病患者之间其Gly40及Ser40等位基因频率差异有显著和非常显著意义，而与日本人、德国人、犹他洲人、芬兰人、英国人和俄罗斯人2型糖尿病患者之间差异无显著意义（χ2≥0.59，P＞0.05）。

图　GCG-R基因第二外显子PCR-DGGE分析

　　三、讨论

　　我们在应用灵敏度低，但能清晰简便地检测出已知突变的PCR-RFLP技术检测研究对象是否存在Gly40Ser突变的同时，再应用能检测DNA序列中几乎所有突变的PCR-DGGE技术，进一步验证PCR-RFLP的 检测结果，并就此外显子是否存在其他变异进行检测。结果显示：无论是2型糖尿病患者还是健康对照者，其GCG-R基因第2外显子均不存在变异，表明GCG-R基因Gly40Ser突变与本地区汉族人2型糖尿病不存在关联。这与日本人、德国人、芬兰人、俄罗斯人和美国犹他洲人的群体相关研究所得结论相同。提示GCG-R基因Gly40Ser突变参与糖尿病的发病可能存在种族或地域异质性。

　　基金项目：云南省应用基础研究基金(编号96C135M)资助

　　参考文献

　　1，Hager J, Hansen L, Vaisse C, et al. A missense mutation in the glucagon receptor gene is associated with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Nature Genetics, 1995, 9: 299-304.

　　2，段勇，王玉明，赵淮，等. 从血细胞快速抽提DNA的方法探讨. 昆明医学院学报，1998，19(2）: 28-30.

　　3，段勇，王玉明，宋滇平，等. 应用PCR扩增GCG受体基因第二外显子的实验条件研究. 陕西医学检验，1998，13(3): 24-26.

　　4，Fischman SG, Lerman LS. DNA fragments differing by single base-pair substitution are separated in denaturing gradient gels: correspondence with melting theory. Proc Natl Acad Sci, 1983, 80: 1579-1583.

　　5，王玉明，段勇，宋滇平，等. PCR－DGGE扫查胰高糖素受体基因的实验条件研究. 昆明医学院学报,1999，20: 1-4.