肿瘤患者凝血及纤溶分子标志物变化

　　【摘要】　目的　观察恶性肿瘤患者凝血及纤溶分子标志物的变化，以探索其发生、发展与止凝血的关系。方法　用ELISA方法检测25名正常对照，20例子宫肌瘤，91例恶性肿瘤（肺癌21例、食道癌20例、胃癌23例、结直肠癌27例）组织因子（TF）、组织因子途径抑制物（TFPI）、凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）、尿激酶型纤溶酶原激活物（u-PA）、尿激酶型纤溶酶原激活物受体（u-PAR）、纤溶酶-抗纤溶酶复合物（PAP）的血浆含量。结果　各种恶性肿瘤TF、TAT、u-PA、u-PAR、PAP均显著高于正常对照组，TFPI水平与正常对照组之间无统计学差异；手术后恶性肿瘤组TF、TAT、PAP有所下降，但仍高于正常对照组，而u-PA、u-PAR已与正常对照组之间无统计学差异；子宫肌瘤患者的上述指标测得值与正常对照组之间无统计学差异。结论　恶性实体肿瘤，存在着明显的凝血、纤溶激活状态。TF、TAT、u-PA、u-PAR及PAP可以作为良、恶性肿瘤鉴别的辅助指标，u-PA、u-PAR可以作为判断预后的指标。

　　Variation of coagulation and fibrinolytic molecular markers in tumor patients

WANG Xuefeng　ZHAO Weili　QU Bin

　　（Department of Laboratory, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Hematology, Shanghai 200025, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the variation of coagulation and fibrinolytic molecular markers in tumor patients and their relationship with tumor incidence and development. Methods　The plasma levels of tissue factor (TF) and its inhibitor (TFPI ), thrombin-antithrombin complex (TAT), urokinase-type plasminogen activator ( u-PA ) and its receptor (u-PAR), as well as plasmin-antiplasmin complex (PAP), were measured using ELISA in 20 patients with hysteromyoma and 91 patients with malignant tumors including lung cancer 21, esophageal cancer 20, gastric cancer 23, and colorectal carcinoma 27.Results　The plasma level of TF, TAT, u-PA, u-PAR, and PAP in group of malignant tumor were significantly higher than that of normal controls (P＜0.05～0.01). TF and TAT increased significantly after operation. However, all these parameters did not vary in patients with uterus myoma.Conclusion　Activation of coagulation and fibrinolysis existed in patients with malignant tumor. TF, TAT, u-PA and u-PAR might also be clinical useful markers for tumor determination and u-PA and u-PAR for tumor prognosis.

　　【Key words】　Thrombin;Plasminogen activators;Carcinoma

　　止凝血异常在肿瘤的浸润、转移过程中起重要作用，二者的关系日益受到人们的重视。我们对部分止凝血分子标志物在肿瘤患者体内变化进行观察，现报道如下。

　　材料与方法

　　一、材料

　　正常对照组25名，男15名，女10名，年龄35～70岁，均为本院健康职工中的志愿者，采血前1个月无服药史。患者组子宫肌瘤组 20例，肺癌组 21例，食道癌组 20例，胃癌组 23，结直肠癌组27例。所有病例接受外科手术治疗后肿块均经病理检查证实。

　　二、方法

　　1.标本制备：正常对照及患者组术前和术后15 d 清晨空腹采血，经129 mmol/L柠檬酸三钠9∶1抗凝，3 000 r/min离心15 min，取上清血浆置-20℃冰箱待测。

　　2.测定指标：(1)组织因子（tissue factor，TF）；(2)组织因子途径抑制物（tissue factor pathway nhibi-tor，TFPI）；(3)凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin，TAT）；(4)尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase type plasminogen activator，u-PA）；(5)尿激

表1　恶性肿瘤患者分子标志物的改变

组别	例数	TF(ng/L)	TFPI(μg/L)	TAT(μg/L)	u-PA(μg/L)	u-PAR(μg/L)	PAP(μg/L)
正常对照	25	33±10	63±25	1.5±0.6	0.45±0.16	0.31±0.12	0.26±0.10
肺癌术前	21	60±28**	76±34	5.0±1.8***	0.60±0.31*	0.42±0.15**	0.57±0.17***
肺癌术后	21	43±28	67±20	4.0±2.0**	0.34±0.20	0.39±0.21	0.38±0.17*▲
食道癌术前	20	51±33**	69±20	4.2±1.8**	0.85±0.40*	0.53±0.41*	0.53±0.15***
食道癌术后	20	41±12**▲	73±22	2.9±1.0*	0.57±0.22	0.41±0.21	0.38±0.16**▲▲▲
胃癌术前	23	48±14**	67±29	4.8±2.8***	0.63±0.28*	0.43±0.22*	0.59±0.15**
胃癌术后	23	36±7▲▲	70±17	3.7±1.9**	0.36±0.17▲▲	0.38±0.17	0.39±0.17*▲▲▲
结肠癌术前	27	45±17**	58±20	3.9±2.4***	0.54±0.15*	0.45±0.29*	0.35±0.14*
结肠癌术后	27	32±8	59±18	3.0±1.2	0.43±0.18	0.36±0.20	0.30±0.16
子宫肌瘤术前	20	28±10	57±26	2.0±0.9	0.34±0.19	0.22±0.12	0.39±0.14

　　注：与正常对照组比较*P＜0.05，**0.05＜P＜0.01，***P＜0.001；与自身手术前比较*P＜0.05，**0.05＜P＜0.01，▲▲▲P＜0.001

表2　局部浸润、肿瘤周围淋巴结转移、其他脏器转移与分子标志物的改变

组别	例数	TF(ng/L)	TFPI(μg/L)	TAT(μg/L)	u-PA(μg/L)	u-PAR(μg/L)	PAP(μg/L)
正常对照	25	33±10	63±25	1.5±0.6	0.45±0.16	0.31±0.12	0.26±0.10
局部浸润(-)	33	52±26**	67±22	4.6±2.7***	0.34±0.24	0.44±0.32*	0.49±0.22*
局部浸润(+)	43	53±24**	69±31	4.7±3.3***	0.84±0.67▲▲▲	0.53±0.37**	0.49±0.16**
周围淋巴结(-)	38	50±24**	72±27	4.9±3.5***	0.31±0.24	0.41±0.29	0.54±0.22**
周围淋巴结(+)	38	54±26***	64±28	4.5±2.5***	0.89±0.69**▲▲▲	0.57±0.39**▲	0.51±0.14*
远处脏器转移(-)	57	51±22**	67±25	4.7±3.2***	0.43±0.28	0.44±0.32*	0.49±0.20*
远处脏器转移(+)	19	57±33***	70±34	5.0±2.3***	1.20±0.83***▲▲	0.64±0.42**▲	0.49±0.13**

　　注：与正常对照组比较*P＜0.05，**0.05＜P＜0.01，***P＜0.001；与阴性组比较▲P＜0.05，▲▲0.05＜P＜0.01，▲▲▲P＜0.001酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase type plasminogen activator receptor，u-PAR）；(6)纤溶酶-抗纤溶酶复合物（plasmin-antiplasmin，PAP）的血浆含量。所有指标均采用ELISA法，除TAT由德国Bering公司生产，其余试剂均为美国ADI公司产品。

　　3.统计学处理：数据以±s表示，采用配对比较t检验。结果

　　1.患者组分子标志物变化：表1显示在肺癌、食道癌、胃癌、结直肠癌组手术前TF、TAT、u-PA、u-PAR、PAP均高于正常对照组（P＜0.05～0.001）；术后上述4组肿瘤TF、TAT、PAP已有所下降，但仍高于正常对照组（P＜0.05～0.01）；手术前后上述4组肿瘤的TFPI变化与正常对照组之间差异无显著意义（P＜0.05）；子宫肌瘤组所有测定值与正常对照组之间差异无显著意义（P＞0.05）。

　　2.局部浸润、肿瘤周围淋巴结转移、其他脏器转移与分子标志物的改变：我们发现凡有局部浸润、肿瘤周围淋巴结转移、其他脏器转移的患者，其u-PA、u-PAR较无这些改变的患者有不同程度的升高（表2）（0.05＜P＜0.001）。

　　3.我们对恶性肿瘤组中的鳞状细胞癌及腺癌患者的血浆凝血及纤溶分子标志物水平进行了分析，其差别无统计学意义（结果未显示）。

　　讨论

　　本组结果显示，在恶性肿瘤手术前其TF水平均高于正常对照组，术后有不同程度的下降（0.05＜P＜0.01）。TF除作为外源凝血系统的启动者外，其促进细胞增生、肿瘤形成及转移方面的作用备受关注。肿瘤细胞的TF表达，在调节血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）合成上有重要作用，Mamora等［1］报道二者有着非常好的相关性。 VEGF导致了肿瘤的新生微小血管大量生成及促进了转移的发生。Reet等［2］用免疫化学方法对191例非小细胞性肺癌的研究发现，TF阴性的肿瘤的微小血管密度通常较低，TF阳性的肿瘤VEGF往往为阳性；该作者还发现，TF阳性的肺癌患者的生存时间较TF阴性者短。TF的生物活性主要由TFPI来进行调节，后者主要由内皮细胞、巨核细胞合成，通过FXa的依赖方式抑制TF-FVIIa复合物的凝血活性。

　　我们的结果显示各恶性肿瘤组其TFPI的量与正常对照组之间差异均无显著意义（P＞0.05），说明TFPI与实体肿瘤止凝血异常的关系不明显。

　　Hiroaki等［3］报道肿瘤细胞表达TF mRNA与TFPI mRNA没有直接联系。由于恶性肿瘤患者的TF水平较高而TFPI水平没有相应的改变，造成凝血系统的激活，凝血酶大量形成，从而导致纤维蛋白原转化为纤维蛋白。纤维蛋白的形成在肿瘤的转移过程中有相互对立的两大作用，（1）包裹原发肿瘤以抑制癌细胞逃逸；（2）捕获血液循环中的肿瘤细胞，造成癌细胞的转移。近年来，有作者提出TF的这种促进血管新生及肿瘤细胞转移的作用可能与其激活凝血的机制截然不同［4］。

　　我们根据恶性肿瘤组有无临近组织的浸润、淋巴结转移、远处脏器转移等情况，将患者进行分组比较，发现：各组TF与TAT除与手术前差异有显著意义外，其组织浸润、淋巴结转移、远处转移的有无均与TF及TAT无关，说明TF、TAT在肿瘤的良、恶性鉴别上有一定意义，但对于患者的预后判断没有实际意义。

　　纤溶系统在肿瘤的生长、浸润及转移中所起的作用引起人们广泛的重视。u-PA是以无活性的酶原pro- u-PA的形式被分泌并与肿瘤细胞表面的u-PAR结合，该结合可以在肿瘤表面集中蛋白溶解活性，pro- u-PA若被激活，即可以使纤溶酶原（plasminogen，PLG）转化为PL，PL有着广谱的蛋白水解活性，可以水解多种细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，如板层素(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)、entactin、前金属蛋白酶（pro-metalloproteinase）等，ECM一旦被激活，可以使肿瘤组织周围的胶原组织水解，从而促进肿瘤细胞侵入临近组织以及转移的发生。Crowley等［5］通过封闭肿瘤细胞表面的u-PAR，明显地抑制了实验动物的肿瘤转移。

　　我们对u-PA、u-PAR、PAP的检测结果显示，各恶性肿瘤组术前上述三指标均显著高于正常对照组（P＜0.05～P＜0.001），术后有不同程度的降低。表2的结果显示肿瘤若发生局部浸润、淋巴结或远处脏器转移，其u-PA、u-PAR均比无此类病理改变者高。一般认为，肿瘤细胞表达u-PA的多少与其浸润、分化程度有关，发生淋巴结转移时u-PA的表达高于无淋巴结转移时。肿瘤若侵入血管，其u-PAR的mRNA表达要明显高于无血管侵入者；此外，VEGF同样与u-PAR的mRNA表达有关［6］，由于VEGF的表达上调，使肿瘤周围的新生微小血管增多，伴随着u-PA造成的ECM的水解，可以促使肿瘤转移的发生。所以，u-PAR目前也被公认为是判断肿瘤患者预后的一个重要指标。PAP是体内纤溶酶形成的分子标志物，虽然表2的结果显示出恶性肿瘤时PAP的增高代表了纤溶酶的生成，但其变化与肿瘤的浸润、淋巴结及远处脏器转移无关，因此这一指标不能用来判断恶性肿瘤的预后。

　　在本组所涉及的4种恶性肿瘤中，将鳞状细胞癌与腺癌患者的TF、TFPI、TAT、u-PA、u-PAR、PAP进行比较，差异无统计学意义（结果未显示）。提示这二种恶性肿瘤细胞对凝血和纤溶的激活程度相仿。

　　我们将子宫肌瘤患者的TF、TFPI、TAT、u-PA、u-PAR、PAP与正常对照组进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示良性肿瘤对于止凝血的影响不显著。

　　总之，恶性肿瘤的患者存在着明显的止凝血功能紊乱，而良性肿瘤这种改变不显著。据此，凝血、纤溶的分子标志物可以作为良恶性肿瘤鉴别诊断的依据。此外，u-PA、u-PAR可以作为恶性肿瘤患者判断预后的辅助指标。

　　参考文献

　　1，Mamoru S, Wayne WH, Keisuke A, et al. Activaton of coagulation and angiogenesis in cancer. Ae J Pathol,1998,152:399-411.

　　2，Reet K, Manfred V. Tissue factor expression in human non-small-cell lung carcinoma measured by immunohistochemistry: correlation between tissue factor and angiogenesis. Int J Cancer,1998,79:19-22.

　　3，Hiroaki K，Hirofumi U，Yujiro A，et al. Analysis of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor expression in human colorectal carcinoma cell lines and metastatic sublines to liver. Int J Cancer,1997,72:878-884.

　　4，Bromberg ME,Girard TJ,Novotny WF, et al.Tissue factor promotes melanoma metastasis by a pathway independent of blood boagulation. Proc Nat Acad Sci, 1995,92:8205-8209.

　　5，Croweley CW,Cohen RL, Lucas BK,et al.Prevention of metastasis by inhibition of the urokinase receptob. Proc Nat Acad Sci, 1993,90:467.

　　6，Nakata S, Ito K, Fujimori M, et al. Involvement of vascular endothelial growth factor and urokinase-type plasminogen activator receptor in microvessel invasion in human colorectal cancers. Int J Cancer,1998,79:179-186.