细菌快速裂解方法研究

　　16S-23S rRNA基因是位于16S rRNA基因与23S rRNA基因之间的区间序列，具有较好的保守性和相对的可变性，被认为是细菌鉴定的合适部位［1，2］。我们认为能否快速有效地扩增该区间，聚合酶链反应(PCR)扩增前的标本处理是关键。故比较了3种裂解细菌的方法。

　　一、材料与方法

　　1.菌株、人类基因组DNA及病毒株来源：革兰阳性6个菌种，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等共19株；革兰阴性21个菌种，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、绿脓假单胞菌等共40株。以上菌株由浙江省临床检验中心及结核病防治中心提供，保存于我院细菌室。人类基因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒由本院中心实验室提供。

　　2.临床标本：1999年6月～2000年3月本院新生儿住院患儿，部分为普通病房住院患儿。败血症血标本42份，脑脊液标本6份。对照组15份，为本院新生儿病房非感染患儿康复期待出院者的血标本。

　　3.16S-23S rRNA基因区间序列引物设计：在细菌的16S rRNA基因的3′端及23S rRNA基因的5′端的保守序列内，经计算机软件查阅自行设计引物。

　　4.临床标本处理：血标本：0.5 ml的肝素抗凝血置室温约10 min以沉淀血细胞，在血清与血细胞的交界面（即白细胞层）吸取200 μl，注入1.5 ml灭菌的Eppendorf管中。加入0.87%的NH4Cl 1 ml，摇匀，放入37℃水浴箱中。15 min后，取出，1 000 r/min离心5 min，去上清液，在沉淀物中加NH4Cl 1 ml，重复上述步骤2次。最后在沉淀物中加5% Chelex 100缓冲液（含0.03% SDS，1%吐温 20，1% NP 40 ）200 μl和蛋白酶K 2 μl（20 mg/ml），56℃孵育60 min后煮沸15 min，稍加离心后，取上清液做PCR扩增。

　　脑脊液标本：0.5 ml～1 ml脑脊液1 000 r/min离心1 min，去上清液，在沉淀物中加5% Chelex 100缓冲液200 μl和蛋白酶K 2 μl，56℃孵育 60 min后再煮沸15 min，稍加离心后，取上清液做PCR扩增。

　　二、结果

　　1.Chelex 100改良裂解法能裂解所研究的所有菌种，且扩增产物条带清晰，效果满意。用经典的酚氯仿抽提法扩增细菌，效果同Chelex 100改良法，但步骤繁琐［3］。

　　2.临床标本的裂解：42例新生儿败血症血培养15例阳性，血标本经改良Chelex 100裂解，PCR扩增后27例阳性，其阳性率明显高于血培养，差异有显著性意义（P＜0.01）。血培养阳性的15例PCR检测均阳性，且检测结果与血培养一致。另1组单纯用水煮裂解，只有5份阳性。6份脑脊液培养2例阳性，脑脊液PCR检测4例阳性，培养阳性的2例与PCR结果相符。15份对照组血标本血培养及PCR检测均阴性。

　　3.敏感性及引物特异性试验：取潘尼变形杆菌标准菌株放入1 ml的dd H2O中，用麦氏比浊法确定起始浓度为108 CFU ，用dd H2O 1∶10定量稀释，浓度范围为2.5×104～2.5×10-3CFU，取2 μl模板在50 μl的PCR体系中扩增，检测扩增下限。Chelex 100缓冲液裂解法得PCR的最小检出量为2.5 CFU/ml。本对引物只能扩增细菌，与人基因组DNA、新型隐球菌、巨细胞病毒无交叉反应，说明本对引物扩增细菌16s-23srRNA基因有较好的特异性。

　　三、讨论

　　本研究首次在Chelex 100的基础上进行改良，加上其他一些试剂配成一种适合不同菌种（包括葡萄球菌在内）PCR扩增的裂解液。并发现用Chelex 100改良法裂解细菌后所扩增的条带较明亮清晰，效果满意，可检测2.5 CFU/ml的细菌，敏感性比水煮法提高了100倍。用经典的酚/氯仿抽提细菌DNA再行PCR扩增，效果与Chelex 100改良法相同。但经典的方法步骤较繁琐，DNA经常从1管转移到另1管，且还要使用多种试剂，这都增加了PCR污染的可能性。故Chelex 100改良裂解法是一简便有效的方法，适合于不同菌株的扩增。

　　总之，经标准菌株和临床标本的初步应用，证明本研究建立的用Chelex100 改良法一步扩增细菌的16S-23S rRNA基因区间具有准确、敏感、简便、快速的特点，若经大量临床标本的进一步证实，可成为一理想的诊断技术。

　　基金项目：浙江省自然基金资助项目(398426)

　　参考文献

　　1，Roth A, Fischer M, Hamid ME, et al. Differentiation of phylogenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequences. J Clin Microbiol, 1998,36:139-147.

　　2，傅君芬，洪文澜.16S-23S rRNA 区间序列——一种分型及鉴别细菌的新方法《国外医学》流行病. 传染病分册,1998,25：245-249.

　　3，尚世强 ，洪文澜 ，俞惠民，等. 细菌DNA的聚合酶链反应扩增及反相杂交初步分型. 中华医学检验杂志 ,1998,21：281-284.