气相色谱法检测极长链脂肪酸的诊断价值

　　【摘要】　目的　检测已确诊为脑白质病变、并被拟诊为肾上腺白质营养不良(ALD)的患者，及可疑女性基因携带者血浆极长链脂肪酸（VLCFA）的水平，以明确诊断及检出杂合子。方法　应用气相色谱技术，检测了83例脑白质病患者及10例疑为基因携带者的血浆VLCFA，包括C26∶0含量，C26∶0/C22∶0和C24∶0/C22∶0的比值三项指标。结果　在83例患者中，三项指标均显著升高者9例，均不升高者66例，确诊率达90.4%。三项指标均中度升高和仅C26∶0/C22∶0和C24∶0/C22∶0显著升高者各2例，高度怀疑为ALD。10例可疑女性基因携带者中三项指标均显著升高者2例，均不升高者4例。结论　气相色谱技术检测血浆VLCFA的方法简便，结果稳定，是目前确诊ALD及检出大多数杂合子的关键手段。

Determination of plasma levels of very long chain fatty acids by gas chromatography

CHEN Jun　ZHANG Jian　XUE Qiming

　　（Laboratory of Neurochemistry, Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Affiliated Hospital of Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China）

　　【Abstract】　Objective　To determine plasma levels of very long chain fatty acids（VLCFA） of patients suspected to be undetermined type of leukoencephalopathy by MRI and diagnosed to be adrenoleukodystrophy(ALD), as well as suspected female carriers in order to verify the clinical diagnosis and detect the carriers.Methods　By using gas chromatography to study plasma levels of VLCFA in 83 cases of suspected ALD and 10 cases of suspected carriers, including three markers(level of C26∶0, ratios of C26∶0/C22∶0 and C24∶0/C22∶0)respectively.Results　Among 83 cases, 9 cases had 3 markers increased and 66 cases decreased. The verification rate was 90.4%. Two cases showed moderate increase in all the 3 markers, and another 2 cases showed marked increase in C26∶0/C22∶0 and C24∶0/C22∶0 levels, suspected to be a probable diagnosis of ALD. Among 10 supected female carriers, 2 cases showed an increase in the 3 markers, and 4 cases a decrease.Conclusion　The determination of plasma VLCFA has been considered a simple ,convenient and stable method for the verification diagnosis of ALD patients and detection of most of the carriers.

　　【Key words】　Fatty acids;Chromatography, gas;Adrenoleukodystrophy;Plasma

　　过氧化体病是一类由于过氧化体数量/结构异常或一种/一种以上过氧化体酶缺陷所致的遗传代谢性疾病，其中以X-连锁肾上腺白质营养不良（X-linked adrenoleukodystrophy,X-ALD）最为常见。该病系X-连锁隐性遗传病，其生化异常为过氧化体极长链脂肪酸-CoA合成酶缺陷并导致极长链脂肪酸（very long chain fatty acids, VLCFA）的β-氧化障碍，从而表现为VLCFA的异常累积。X-ALD的表型多样，从影像学检查中又缺乏特异性的指标。在目前，多广泛采用检测血浆VLCFA的方法以确诊此病。在X-ALD病人中，血浆C26∶0的浓度多有明显升高，而且C26∶0与C22∶0浓度之比（C26∶0/C22∶0）及C24∶0与C22∶0浓度之比（C24∶0/C22∶0）也往往同时升高。此外，对于大多数女性基因携带者（杂合子）也可通过此法检出。

　　近年来随着核磁共振(MRI)的广泛应用，以及临床医生对X-ALD及其他过氧化体病的深入了解，被诊断为脑白质病却不能明确病因，及初步诊断为ALD而又难以确诊的患者较前有所增多，因而血浆VLCFA检测就显得日益重要。我室在原有工作［1］的基础上，参照Moser等［2］的方法并结合实验室自身条件，应用气相色谱（GC）技术检测了83例经临床表现和影像学检查证实为脑白质病患者及10例可疑女性基因携带者的血浆VLCFA。现将实验方法及结果报告如下。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.试剂：无水甲醇、二氯甲烷、乙酰氯、正己烷、乙腈、氯仿、碳酸钾。以上均为北京化工厂产品，分析纯。乙酰氯、无水甲醇、正己烷均重新蒸馏后使用。

　　2.标准品：C22∶0、C24∶0、C26∶0及C27∶0四种脂肪酸及其甲酯为Sigma公司产品。

　　3.仪器：气相色谱仪，岛津GC-9A型；毛细管柱，SEG BPX70 0.22 mmΦ×30 m；数据处理机，岛津C-R6A型；XH-1高纯氢发生器，北京信和诚科技发展有限公司。

　　二、实验方法及注意事项

　　（一）标本的前处理

　　1.取空腹静脉血3～5 ml，肝素抗凝，于1 h内离心，分离血浆，置低温冰箱保存。要注意溶血可能会造成假阳性。

　　2.甲酯化处理：（1）取10 ml带盖（盖内须衬以聚四氟乙烯膜）螺口试管，用氯仿-甲醇（2∶1）溶液冲洗、干燥后，加0.25 ml血浆、1 ml甲醇-二氯甲烷（3∶1）溶液，摇匀；（2）准确加入内标物C27∶0甲酯5 μl（浓度为1 μg/μl，溶剂为正己烷）；（3） 在通风橱内，极缓慢地滴入200 μl乙酰氯，同时轻轻摇动试管；（4）旋紧试管盖，置75℃恒温水浴箱1 h；（5）取出试管，待其冷却后，缓缓加入7％碳酸钾溶液4 ml，再加2 ml正己烷，混匀，以2 500 r/min，离心10 min；（6）收集上层正己烷相放入另一试管，加2 ml乙腈，彻底混匀，离心5 min，2 000 r/min。收集上层正己烷相于一尖底小试管；（7）用氮气（N2）吹干收集的正己烷相，气流大小一定要适当，以免管内液体溅出；（8）在GC分析前，加入50 μl正己烷充分溶解N2干燥的组分。

　　（二）GC分析条件

　　色谱柱室由180℃升至220℃，升温速率2℃/min，载气流速70 ml/min，进样器和氢火焰检测器为260℃，3 μl进样。

　　（三）脂肪酸甲酯标准曲线的制备

　　用正己烷作溶剂,配制4组标准脂肪酸甲酯溶液，所含C22∶0、C24∶0、C26∶0和C27∶0的浓度(μg/μl) 分别为第一组：0.2、0.2、0.02、0.1；第二组：0.1、0.1、0.01、0.1；第三组:0.05、0.05、0.005、0.1；第四组：0.025、0.025、0.002 5、0.1。经 GC分析后得到峰高（H）- 浓度（C）的标准曲线。以Hi/Hs为坐标横轴，Ci/Cs为坐标纵轴，其中i代表各组分，s代表内标物。计算出各组分标准曲线的直线回归方程。

　　（四）定性及定量分析

　　采用保留时间法对待测样品中C22∶0、C24∶0及C26∶0各组分定性，利用所得标准曲线或回归方程计算出各组分的血浆浓度。

　　三、实验对象

　　1.对照组：20名，年龄4～45岁，男12名，女8名。

　　2.ALD组：9例，均为男性，年龄2～37岁。

　　3.脑白质病组：83例，其中男64例，年龄9个月～42岁；女19例，年龄5～43岁。

　　4.可疑杂合子组：10例，其中8例为男性脑白质病患者之母，2例为1名X-ALD患者（由外院确诊，已死亡）的姐妹，均为成年人。

　　结果

　　1.按照上述实验方法和GC分析条件，所得色谱图见图1。各组分可较好分离。

　　2.精密度试验：取对照组中1名正常人血浆8份，每份250μl，同时进行前处理和色谱分析，求得批内变异系数（CV）C22∶0为3.8%，C24∶0为3.7%，C26∶0为3.9%，两个月内共测定6次，求得批间变异系数C22∶0为4.0%，C24∶0为3.9%，C26∶0为4.0%。

　　3.回收试验：取1份对照组中正常人血浆，按上述方法测得C22∶0为19.512 μg/ml，C24∶0为19.372 μg/ml，C26∶0为0.465 μg/ml，然后加入C22∶0 20 μg/ml、C24∶0 20 μg/ml、C26∶0 4 μg/ml的标准品，再次测定，共进行3次回收试验，所得回收率C22∶0为(94.2±1.6)%，C24∶0为(94.8±1.3)%，C26∶0为(95.0±0.9)%。

　　4.对照组、ALD组检测结果：见表1。

　　统计分析显示，ALD组的三项指标均显著高于对照组（P＜0.001），C22∶0含量显著低于对照组（P＜0.05），这点与我室曾报道的结论［1］相一致。由于实验方法不同，或者实验条件、操作人员的不同，各实验室所测结果也不完全一致，但最终的结论是相同的。所以，每一实验室均应有自己的参考值。

　　5.参照国外报道［2］和我们的经验，我们规定C26∶0、C24∶0/C22∶0分别大于对照组均值2～3s为中度升高；3s以上为显著升高；2s以下为未升高。C26∶0/C22∶0大于对照组均值2～4s为中度升高；4s以上为显著升高；2s以下为未升高。据此，脑白质病患者、可疑杂合子血浆VLCFA检测结果中：三项指标显著升高者，男性患者8例，女性患者1例，可疑杂合子2例；三项指标未升高者，男性患者48例，女性患者18例，可疑杂合子4例；三项指标中度升高者，男性患者2例，可疑杂合子2例；仅C26∶0/C22∶0和C24∶0/C22∶0显著升高者2例，均为男性患者；C26∶0中度升高者，男性患者1例，可疑杂合子1例；C24∶0/C22∶0显著升高者2例，均为男性患者；C24∶0/C22∶0中度升高者，男性患者1例，可疑杂合子1例。