美国疾病控制与预防中心血脂标准化工作简介

 　美国疾病控制与预防中心(CDC)自50年代开始研究和推行血脂测定标准化。多年来，他们的血脂测定参考方法和参考材料一直作为美国和许多其他国家血脂测定的准确性基础；他们的血脂标准化计划为美国和世界上许多心血管病研究的血脂标准化和临床实验室血脂分析质量的提高做出了突出贡献。了解他们的血脂标准化工作有助于我国血脂标准化的开展。

　　一、概述

　　血脂标准化的核心是准确性的可溯源性。要开展标准化工作，首先要建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后再将准确性转移到常规分析中去，或使常规分析的准确性可溯源到参考系统所提供的准确性基础上。完整的参考系统包括决定性方法、一级参考物质、参考方法和二级参考物质。目前美国已有总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)决定性方法，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)由于被分析物存在形式的复杂性和目前技术水平的限制，则只有参考方法。TC、TG决定性方法是由国家标准与技术研究所(NIST)建立的［1，2］，CDC建立并维持TC、TG、HDL-C和LDL-C参考方法［3］，其中TC参考方法是国家临床实验室标准委员会(NCCLS)的国家胆固醇参考系统(NRS/CHOL)的组成部分，TG、HDL-C和LDL-C参考方法也已为国家胆固醇教育计划(NCEP)所推荐［4～6］。决定性方法由于其技术和成本的高要求，一般只用于参考方法的评价和监督，而参考方法往往是日常标准化工作的主要角色。目前CDC的TC、TG、HDL-C和LDL-C参考方法和用参考方法准确定值的冰冻血清参考物质实际上在为美国和世界上许多国家的血脂分析提供准确性基础。

　　转移准确性需制定转移计划，亦即标准化计划。CDC与国家心肺血液研究所(NHLBI)的血脂标准化计划是世界上最早的血脂标准化计划。此计划主要通过经参考方法准确定值的冰冻血清物质转移准确性。使用定值血清转移准确性是最简便、最经济的标准化方法，但适合大规模生产、贮存和运输的血清难免要经过一定的处理，如冰冻、冻干等，而这些处理会在一定程度上改变血清性质，使某些分析系统的分析结果出现偏差，即产生基质效应。为此，CDC于1988年建立胆固醇参考方法实验室网(CRMLN)，以便仪器、试剂生产厂家和临床实验室直接用新鲜血清与参考方法对比分析结果。

　　下面将分别对CDC参考方法、参考血清、CDC-NHLBI血脂标准化计划和CRMLN作简单介绍。另外，质控调查计划在血脂标准化中也起重要作用，它们与CDC参考系统的关系也将作简单介绍。

　　二、CDC血脂参考方法

　　1.TC：TC参考方法为Abell-Levy-Brodie-Kendall(ALBK)法，包括皂化、提取、显色和比色等步骤。此法移液步骤多，提取和显色也需严格控制，一般情况下难以得到可靠结果。CDC能成功地用作参考方法是由于他们在以下方面做了改进。(1)取样和各部移液均用高性能自动稀释器操作，保证了移液精密度。(2)在取样过程中使用了冲洗程序，即用醇性氢氧化钾(皂化剂)将标准和样品冲入试管中，避免了样品(血清)和标准(乙醇溶液)由于基质不同而对取样准确度的影响。(3)确保提取完全。由于标准和样品的基质不同，胆固醇在提取系统的两相间的分配速度不同，故提取是ALBK法的关键步骤之一。(4)用计算机将标准、样品和质控的分析顺序随机化，以便明察各分析步骤出现任何系统性漂移。经此改进的ALBK法精密度能达到变异系数(CV)小于1%，一次最多可分析120个试管，与决定性方法之间的偏差约+1.6%。此法用NIST的胆固醇一级标准物质SRM 911b作标准。此法除用于TC测定外，也用于HDL-C和LDL-C参考方法中的各项胆固醇测定。

　　2.TG：TG不是单一化合物，其测定比胆固醇复杂得多。目前CDC的TG参考方法分两部分，一部分为“净”TG的化学测定法，另一部分为游离甘油的同位素稀释气相色谱质谱法。TG化学法中用二氯甲烷提取TG，用硅酸吸附各种邻羟基化合物和磷脂，用醇性氢氧化钾水解TG为甘油，用高碘酸氧化甘油，使生成的甲醛与变色酸反应后用比色法测定。取样、提取和皂化中的各步液体转移用稀释器操作，氧化、还原、显色和比色在流动注射分析仪上进行。每次分析的流动注射分析部分都包括一套甘露醇标准，以便结果出现问题时判断问题的来源。此法用Supelco的三油酸甘油酯和NIST的三软脂酸甘油酯标准物质SRM1595的2∶1混合物作标准。此法的精密度为2%～6%。与决定性方法的初步对比结果显示，此法的测定值不仅是TG，还包括(或部分包括)甘油二酯和甘油一酯。

　　游离甘油的测定用1，3-13C2甘油作内标，用甲醇沉淀蛋白并提取甘油，用正己烷洗去甲醇提取液中的少量脂质，将甲醇提取液挥发干，经衍生后用气相色谱分离、质谱检测甘油衍生物。此法是1992年建立的，建立此法的原因是目前绝大多数TG常规分析用酶法测总甘油，测游离甘油的试剂尚不十分可靠，单独一个测净TG的参考方法难以满足TG标准化的需要。

　　3.HDL-C和LDL-C：血清不同脂蛋白之间没有明确的界限，其理化性质存在一定重叠，准确测定他们的胆固醇含量十分困难。HDL-C和LDL-C标准化首先要定义HDL和LDL，其依据应是目前血脂与心血管病关系研究资料中HDL和LDL的定义。目前CDC的HDL-C和LDL-C参考方法为超速离心-化学沉淀法(β定量法)。用超速离心法去除血清中密度小于1.006的组分(顶部组分，主要为乳糜微粒和极低密度脂蛋白)，测定底部组分(BF)胆固醇(BFC)，用肝素-锰离子试剂沉淀BF中的LDL，测定上清液中的HDL-C，从BFC中减去HDL-C得LDL-C。BFC和 hDL-C的测定均采用ALBK法。LDL-C中包括脂蛋白(a)和中间密度脂蛋白。

　　4.血清参考物质：CDC血清参考物质一直是CDC血脂参考系统的重要组成部分，绝大多数准确性转移都是通过这些物质实现的。CDC血清参考物质是经参考方法准确定值的冰冻混合血清。这些物质已有几十年的应用历史，而且应用范围广，是目前性质明确、质量好的血脂分析物质。它们以往的应用主要是TC、TG和HDL-C。LDL-C的标准化工作刚刚开始，初步研究证明LDL-C对冰冻比其它血脂指标敏感，血清冰冻后LDL-C下降，但在参考方法中LDL-C下降发生在冰冻初期，在以后的贮存中不再下降，说明冰冻血清用于LDL-C参考方法的标准化是可行的。CDC血清参考物质的制备过程大致如下。取来自不同个体的血清，测定血脂后冰冻(-70℃)保存，按血脂水平需要将适当水平的血清化冻后混合。高胆固醇血清用添加血清脂蛋白(乙醇沉淀法制备)的方法制备，高TG血清添加蛋黄提取物。混合血清滤过0.22μm的滤膜后分装于玻璃小瓶中，冰冻保存。随机取一定数量的小瓶，用参考方法分析血脂12次，每次分析两瓶，每瓶分析两份，用所得48个结果检验均匀性和计算参考值。

　　三、CDC-NHLBI血脂标准化计划

　　此计划始于1957年。建立此计划的最初原因是当时许多血脂水平与冠心病关系研究要求血脂分析的可靠性和实验室间分析结果的可比性。到目前为止己为100多个美国和国际心血管病研究提供血脂分析标准化。除此之外，它还为血脂分析方法学研究实验室、质控调查计划中的参考实验室和血脂分析仪器试剂生产厂家实验室中血脂分析的质量提高与保证做出了突出贡献。此计划的目前版本如下。

　　1.对象：美国国内的血脂研究实验室、参加流行病学和临床研究的实验室、公共卫生实验室、质控调查计划和标准化活动中的参考实验室；国际上参加重要流行病学和临床研究的实验室。

　　2.标准化程序：分三阶段。第一阶段为初步评价阶段，评价申请者的分析质量及所用分析系统有无基质效应。申请者分析CDC提供的6种冰冻血清6次，每次每种血清分析2份；收集6个病人血清，将每个病人血清一分为二，一组在分析CDC血清的同时分析血脂一次，每种血清分析2份，另一组冰冻后送CRMLN实验室。若申请者分析结果满足此计划的分析质量标准，且无基质效应，进入第二阶段。第二阶段为主要评价阶段，评价申请者血脂分析的精密度和准确度及维持分析质量的能力。申请者分析CDC提供的9种冰冻血清和2种自己血清8次，每次每种血清分析2份。第三阶段评价申请者长期维持分析质量的能力。申请者每季度分析9种CDC冰冻血清和2种自己血清4次，每次每种血清分析2份。进入此阶段的申请者，CDC发给证书，申请者每通过一次季度考核，CDC发给胶签一个，贴在证书的相应位置。证书每年换发一次。

　　四、CRMLN

　　建立此网络的背景是有些血脂分析系统对冻冷血清参考材料有基质效应，它们的分析质量不能通过CDC冰冷材料溯源到参考方法上来。1988年CDC建立了CRMLN，以便于生产厂家和临床实验室直接用新鲜血清与参考方法对比分析结果。目前此网络有美国实验室6家，国际实验室6家，其中的一家亚洲实验室为日本大阪癌症与心血管病医学中心。网络实验室均采用ALBK法测定TC，TG和HDL-C多采用专用对比法，TG为酶法(包括游离甘油和总甘油两部分)，HDL-C为硫酸葡聚糖(50K MW)-镁离子沉淀法。网络与实验室间准确性转移方案如下。

　　1.生产厂家：收集新鲜血清40～50份，将每份血清一分为二，一组4℃贮存，在两天内开始分析血脂，在至少5次分析(8～9份血/次)中完成。另一组冰冻保存，与分析结果一起送网络实验室。质量合格后CDC发给证书。分析系统做明显改动、室内质控出现漂移时，需重新进行对比。

　　2.临床实验室：收集至少6份新鲜血清，将每种血清一分为二，一组分析血脂3次，每次每种血清分析两份。另一组在收集后的当天，送往网络实验室，否则冰冻后送网络实验室。合格后发证书，有效期半年。

　　应该指出，目前此计划的主要服务对象是生产厂家，一方面厂家产品质量影响面广，保证厂家产品质量是血脂标准化的有效手段。另一方面目前食品与药品管理局(FDA)也要求胆固醇产品在上市前的报批资料中包括该产品分析结果与CRMLN分析结果的对比资料。临床实验室目前参加此计划的较少，更多的参加美国国会1988年通过的临床实验室提高分析质量修正案(CLIA′88)要求的质控调查计划。

　　五、质控调查计划与CDC参考系统

　　质控调查计划在血脂标准化中也起重要作用。它们有效地提供实验室间精密度和各实验室准确度情况。CLIA′88规定质控调查作为实验室分析质量的评价手段，并批准了13个质控调查计划，其中影响最大的为病理学家协会(CAP)的计划。血脂质控调查计划每年进行三次，每次5个水平，血脂指标包括TC、TG和HDL-C。CDC自1984年为CAP和美国生物分析学家协会(AAB)等质控调查计划的质控材料测定靶值。但这些靶值并没有直接用于准确性评价(TC除外)，原因是多数质控物质为冻干血清，有些分析系统对此有基质效应，使调查总均值与靶值之间有偏差。但靶值的提供是研究质控物质性质、各分析系统基质效应大小及质控物质改进等标准化中的重要问题所必需的。

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