母血循环中胎儿细胞的研究进展

　　摘要 已经证明早在妊娠5周母血循环中就可监测出胎儿细胞，分离、纯化这些细胞可用于早期胎儿遗传学诊断。常用的胎儿细胞类型为滋养细胞和有核红细胞。目前从母血中分离、纯化胎儿细胞在技术和临床研究上取得了很大的进展，作为一种无创性产前诊断方法其有着一定的临床应用价值，但仍存在一些问题有待解决。

　　目前，获取胎儿细胞进行产前诊断的方法主要有羊膜腔穿刺、绒毛活检和脐血管穿刺。这些手段对胎儿有一定的风险，有可能造成流产。从母血中成功分离出胎儿细胞预示着只需通过简单的静脉穿刺途径即可获得胎儿DNA来源。如果这些细胞的确来自胎儿，临床应用将包括早期诊断胎儿染色体或基因异常。

　　一、分娩后胎儿细胞在母血中持续存在的时间

　　了解分娩后胎儿细胞在母血中持续时间非常重要，因为此次妊娠诊断结果有可能源自前次妊娠的胎儿细胞，得出错误的结论。早在20年前就有作者证实分娩男性胎儿后1～5年母血中仍能检测出男性淋巴细胞。近年由于新方法的出现，发现妊娠结束后胎儿细胞能长期存留于母血。最近一项研究采用敏感的流式分选纯化技术，在娩后长达27年的母血中检测到胎儿细胞。这些细胞几乎均为一种特异性细胞类型，表达分化抗原CD34和CD38，故被认为属于淋巴样或髓样干细胞。由于其在母血中有可能分化出免疫反应细胞，有人提出母血中持续存在的胎儿细胞与某些自身免疫病的发生有关。自身免疫性疾病的发生率在女性人群高于男性，且多出现于生育几年之后。Nelson等发现，患硬皮病妇女（末次分娩男婴平均时间为18.5年）外周血中男性胎儿细胞含量（11.1个/16ml）较正常对照组（0.38个/16ml）显著增高，并且母子间人白细胞抗原（HLA）-II抗原相容性增高，提示妊娠或分娩过程所造成的微嵌合性（microchimerism）可能在硬皮病的发生中起一定作用。

　　二、选择作为无创性产前诊断的细胞类型

　　妊娠期母血中胎儿细胞类型均为分化末期的细胞，主要包括滋养细胞和有核红细胞。滋养细胞的优势在于它的特殊形式，容易辨认。如果在母血中获得如此形态的滋养细胞，其胎源性不容置疑。在正常妊娠早期，胎盘滋养细胞已广泛脱落进入母血循环，但这些细胞又几乎以同样的速度被母亲肺循环所清除。目前分离滋养细胞遇到两个不易克服的困难：①相对缺乏针对滋养细胞表面抗原的单克隆抗体。②正常妊娠时母亲外周血滋养细胞数量不足。但先兆子痫孕妇外周血中滋养细胞数量增多。推测是由于胎盘缺氧，绒毛局部有坏死和脱落所致。且有些染色体核型异常只见于胎盘细胞，而胎儿体细胞核型正常。这种局限于绒毛的嵌合性在所有绒毛活检病例中占1%。

　　1。因此母血中有更多的胎儿红细胞可被分离。另外，在妊娠早期红细胞的发生远早于白细胞。有核红细胞属于分化最后阶段的细胞类型，其最终结局是丢失细胞核并丧失增殖能力。迄今还没有人观察到有核红细胞能持续存在至下次妊娠。但有核红细胞有可能起源自母体本身。人们熟知常规血液学检查如血细胞计数都曾偶见过有核红细胞，现在更新更敏感实验技术已证明母亲外周血中有核红细胞来源于母体和胎儿。在有些情况下如先兆子痫，母体循环中双向来源的有核红细胞比例均增多。

　　有学者从母血中分离出胎儿淋巴细胞并进行了产前诊断，但胎儿淋巴细胞发生相对较晚，孕早期胎儿淋巴细胞尚未大量生成，进入母血循环中的数目更少。即往的胎儿淋细胞在母血中长期存在，影响诊断的准确性。因此，胎儿淋巴细胞难以用于产前诊断。

　　三、胎儿细胞进入母血的时间

　　近来随着方法学的进步，许多学者在妊娠第6周就从母血中检测Y染色体DNA。Thomas等最早在妊娠4周加5d的母血中测出Y染色体DNA。他们的研究对象均为体外受精孕妇，孕期时间计算精确。所有孕妇在7周都可检测到胎儿遗传物质。虽然没有进一步探究男性胎儿DNA的细胞类型，但在妊娠5～8周滋养细胞的可能性最大。

　　四、母血循环中究竟有多少胎儿细胞

　　人们希望知道到底有多少胎儿细胞混入母血循环。从一些流式分选方法结果所得出的结论是母血中胎儿细胞数量很少。为了澄清这种结论是妊娠本身生理状态还是继发于细胞分离纯化实验过程中的细胞丢失，Bianchi等从母亲全血中测定了胎儿细胞的数量。他们避开细胞分离步骤，抽提出全血细胞DNA，利用针对Y染色体长臂特异性序列作引物行聚合酶链反应（PCR）扩增。这也是最简单的区分母亲细胞和胎儿细胞的方法，而且目前尚无一种标记能区别开女性胎儿细胞和母体细胞。最后再确定胎儿的性别和核型。这项研究包括230例中期妊娠妇女，抽取母血量为16ml。199例胎儿核型正常，31例核型异常。结果发现，90例正常男胎的妇女16ml血中胎儿细胞数平均为19（0.1～91），109例正常女胎的妇女检测到的胎儿细胞数平均为2（0～24），显然这些循环中的男性胎儿细胞源于前次妊娠男性胎儿。一个意外的发现是，18例男性Down综合征的妇女母血中胎儿细胞的数量是正常男胎妇女的6倍，平均为110。对于正常男胎的妇女母血中胎儿细胞数量也不一致：25%母血为30～91，25%为10～30，25%为5～10，25%为0～5。这种分布差异的原因不明。如果怀非整倍体胎儿的妊娠允许更多的胎儿非整倍体细胞渗透到母血循环中去，对于产前遗传学诊断是十分有利的。

　　五、胎儿细胞的分离方法

　　目前设计了好几种分离胎儿细胞的实验方法。其原理是根据其独特性阳性选择胎儿细胞或阴性选择即除掉母体特性的细胞。由于母血中胎儿细胞数量甚少，评价一种分离技术主要考察其收获胎儿细胞数量和纯度，是否混有母体细胞。这些方法包括：密度梯度离心法、荧光激活的细胞分选法（flourescence activated cell sorting）、磁场激活的细胞分选法（magnetic activated cell soring）、免疫磁珠法（immunomagnetic beads）、单个细胞微处理法（micromanipulation of individual cells）以及生物素蛋白柱结合法（the use of avidin-conjugated columns）等。

　　六、单克隆抗体

　　用于选择胎儿细胞的单抗也很多，识别胎儿细胞表面或胞浆内蛋白质。当然这些蛋白的表达与胎龄有关。包括：CD71，转铁蛋白受体，CD36，血小板反应素（thrombospondin）受体，血型糖蛋白A（glycophorinA），血型抗原i，血红蛋白F的γ链。用来排除母体细胞的单抗识别：CD45，CD3和CD4，CD19（B淋巴细胞），CD13和CD32（粒细胞），CD14（单核细胞）。当分离的胎儿细胞纯度很低时可使用胎儿细胞识别器。这种装置能在掺有许多母体细胞的涂片上自动、快速地找到胎儿细胞。胎儿细胞识别器根据识别不同的胎儿细胞或胚胎细胞球蛋白分为好几种，例如γ球蛋白，ε球蛋白，ζ球蛋白，Hash2蛋白（滋养细胞特异性蛋白）和HLA-G。

　　七、临床应用

　　Down综合征的发生率约为0.1%，其中有20%其母亲年龄＞35岁，而80%母亲在孕期并无作侵入性诊断的指征。目前，孕中期母血清甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）和雌二醇（E2）浓度的测定已被联合用作21三体征产前无创性检测指标。但这只能作为筛查实验，30%～40%阳性病例被漏诊，且有5%的假阳性。从母血中分离出胎儿细胞是一种新的产前非创性诊断方法，或作为继发性诊断手段证实血清筛查试验阳性者，以减少侵入性产前诊断的人数。血清学诊断对于其他遗传性疾病的诊断作用不大。几乎所有的胎儿染色体异常都可通过胎儿细胞得出诊断，包括21、16三体征等，性染色体异常，三倍体，甚至一些蛋白基因突变，如β地中海贫血。母血胎儿细胞还能用于早期诊断血液因子（Rh）母儿血型不合。这对于RhD阴性但体内抗RhD抗体阳性的孕妇来说，若其丈夫为RhD阳性杂合体，则确定胎儿Rh将十分有利，因为如果胎儿细胞为RhD阴性，将可绕开伴随整个孕期的一系列监测和治疗措施，避免不必要的损失。

　　从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞属于无创性产前诊断，在临床上有一定的应用前景。但由于其操作复杂、费用昂贵以及其自身存在的问题目前尚不能广泛推广。就当前而言，传统的侵入性诊断方法在产前诊断中的地位仍不可取代。

　　参考文献

　　1 Bianchi DW,Zickwolf GW,Weil gj.Proc Natl Acad USA,1996;93:705-708

　　2 Thomas MR,Tutschek B,Frost Aet al.Prenat Diagn,1995;15:641-646

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