免疫防龋的研究新进展

　　龋病被认为是人类最普遍的感染性疾病。关于免疫防龋的研究已有近30年历史。早在60年代末期，国外学者即开始了防龋疫苗的探索，期望通过接种某种防龋疫苗，有效地阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定殖，达到预防龋齿的目的。近年来，运用免疫学手段控制龋病更为其研究的热点。大量研究证实，主动免疫与被动免疫均为有效的防龋手段。我们就近期国内外免疫防龋的研究动态作一评述。

　　一、主动免疫防龋研究

　　主动免疫是用人工接种的方法给机体输入抗原性物质，刺激机体免疫系统产生免疫应答，从而提高机体抗病能力。在主动免疫防龋研究过程中，存在着一些障碍，主要包括三个方面：①变形链球菌（简称变链菌）等致龋菌一般定殖在宿主组织表面，在这些部位难以激发有效的免疫反应；②抗变链菌抗体能与机体组织蛋白特别是心脏组织发生交叉反应，产生免疫复合物介导的疾病如细菌性心内膜炎；③变链菌与口内其他链球菌具有交叉反应性抗原，防龋疫苗介导的免疫反应可能破坏口内正常菌群的生态平衡。因此，多年来学者们一直致力于通过改变免疫原、免疫途径、免疫佐剂和免疫频率等手段，寻找一种安全有效的防龋疫苗。

　　1．全菌疫苗：早期的防龋疫苗研究，主要是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。通过对大鼠、猴等实验动物的免疫研究发现，免疫后的动物唾液和血清中抗变链菌抗体水平明显升高，能有效地抑制变链菌在牙面的聚集，降低龋病的发生率。这一时期的研究充分表明，利用变链菌全细胞多价疫苗可防止龋病的发生。但进一步研究显示，与其他链球菌相似，变链菌某些抗原或成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体。

　　2．纯抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要表面蛋白抗原（ pAc或 agⅠ／Ⅱ、 pl、 spaA等）和葡糖基转移酶（ gTase），它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要作用。近10年的大量研究证实，用 pAc和 gTase主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，且纯化的抗原不会介导心脏交叉反应。但研究者发现，由于纯抗原免疫原性较弱，单一免疫常难以同时激发有效的系统和局部免疫反应。因此，学者们尝试了经口服、鼻内注射、皮下注射和腹腔注射等多种途径并加以佐剂进行免疫。

　　将 pAc或 gTase制备成微乳化的脂质体疫苗，不仅经济、简便，且能激发有效的血清和唾液抗变链菌抗体，明显抑制实验动物龋齿的发生。将 pAc或 gTase与霍乱毒素 b亚单位（ cTB）制备成嵌合疫苗，也是增强抗原免疫性的有效手段，能激发有效的循环抗体和局部粘膜反应。我们（1996）将 pAc与弗氏佐剂乳化后，给 bALB／ c小鼠皮下注射，结果显示，免疫组血清特异性 igG和唾液特异性 igA抗体水平显著升高。

　　葡聚糖结合蛋白（ gBPs）也被证实为有效的候选疫苗。 smith等（1996）将 gBP59给大鼠唾液腺周围皮下注射，明显抑制了鼠牙的光滑面及窝沟龋的发生。

　　3．多肽疫苗：自90代年以来，随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，从分子水平对变链菌 pAc和 gTase的认识逐步深入。目前，编码这两种抗原的基因 pac和 gtf已被克隆，核苷酸序列已基本清楚。用 pAc和 gTase分子中与某特定功能相关并具有免疫原性的核酸序列制备多肽防龋疫苗，已成为免疫防龋研究的热门。目前研究证实， pAc分子的 n末端唾液结合区（ sBR）、粘附功能区（816～1213位残基）、 a区的 t细胞和 b细胞抗原决定簇等； gTase分子的氨基末端的酶促区（ cAT）、羧基末端的葡聚糖结合区（ gLU）和高度保守的酶活性片段（ gGY和 aND）等是理想的候选多肽。

　　由于多肽疫苗仅为病原体的单一保护性抗原或某一抗原决定簇，单纯以游离的多肽免疫动物，常不能产生理想的免疫效果，也需将其结合至大分子载体上以增强其免疫原性。将 pAcSBR与 cT-B嵌合并以 cT为佐剂，经鼻内免疫大鼠，可激发高水平的唾液抗 pAcIgA抗体，并导致实验动物龋活性下降。以 sBR与 cTA2／ b嵌合口服免疫小鼠，也能激发高水平的特异性唾液 sIgA和血清 igG抗体。另外大肠杆菌的热不稳定毒素 b亚单位（ lT-B）也被证实能增加连接的 spaA多肽的免疫原性和生物学活性。

　　另外，改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段。 senpuku等（1996）发现将 pAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段免疫所激发的抗 rPAc抗体明显升高。因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性。 smith等（1997）将 gTF酶活性片段 gGY和 aND以赖氨酸为核心分别构建有8条支链结构的多肽疫苗，经唾液腺周围免疫大鼠，结果显示，将抗原决定簇设计成这种结构具有高度的免疫原性，能诱导高水平的特异性唾液 igA抗体，并使动物龋齿发生率显著降低。

　　4．基因重组疫苗：利用遗传工程技术，将致龋菌毒力因子的结构基因克隆至载体质粒，构建基因重组防龋疫苗，也是很有应用潜力的免疫防龋手段之一。

　　选择安全无毒的载体细菌是基因重组防龋疫苗研究的一个关键环节。目前用于防龋疫苗研究的载体菌主要是减毒的沙门杆菌和乳链球菌。

　　减毒的沙门杆菌能在体内、体外稳定地表达高水平的克隆基因，且重组后仍保持其对肠相关淋巴组织（ gALT） peyer斑的粘附与定殖特性，可以激发较强的局部粘膜免疫反应。用载有茸毛链球菌 spaA基因的0.5kb三个重复片段与另一1.2kb的片段连接，插入质粒 pYA292并转化减毒的沙门杆菌，将获得的重组沙门杆菌免疫大鼠，测得实验组血清抗 spaAIgG和唾液抗 spaAIgA水平明显升高，并导致茸毛链球菌介导的鼠龋齿发生率明显下降。

　　乳链球菌长期用于生产酸奶和奶酪等乳制品，其安全性已广为接受。用乳链球菌作为载体构建的重组体，既具有克隆基因的免疫原性，又对机体安全无害。 iwaki等（1990）通过将变链菌 pac基因连接到穿梭质粒 pSa3上转化乳链球菌，构建携带 pac基因的重组乳链球菌，经小鼠灌胃免疫，可诱导小鼠唾液特异性抗 pScIgA及血清 igG抗体产生。我们（1997）将所构建的基因重组乳链球菌 hL107经不同途径免疫孕兔，观察到孕兔唾液和乳汁中特异性抗 pAc抗体的产生。对定菌大白鼠行灌胃免疫发现，重组乳链球菌能有效刺激大鼠发生特异性免疫应答，防止龋病发生，进一步证明了重组乳链球菌的免疫防龋效能。

　　另外，运用基因工程手段将变链菌的两毒力因子 pAc和 gTF连接构建融合蛋白，也是前景看好的候选防龋疫苗。 yu等（1997）将 pAc富含丙氨酸的唾液结合区（ pAcA）分别与 gTF-Ⅰ的葡聚糖结合区（ gB）和蔗糖结合区（ sB）融合，并在大肠杆菌表达。利用重组融合蛋白 pAcA-GB和 pAcA-SB免疫兔，研究发现，兔抗 pAcA-GBIgG能显著性抑制变链菌非水溶性葡聚糖合成，以及变链菌对唾液包被的 hA的蔗糖依赖性和非蔗糖依赖性粘附；而抗 pAcA-SB的抗体仅能抑制变链菌的非蔗糖依赖性粘附。他们推测 pAcA-GB融合蛋白在体内能明显抑制变链菌对牙面的粘附，具有广阔的应用前景。

　　5．核酸疫苗：近年来，一种新型的疫苗———核酸疫苗正成为世界瞩目的防止感染性疾病研究的热点。它是将编码某种蛋白质的外源性基因（ dNA或 rNA）直接导入动物细胞内，诱导宿主对目的基因所表达的蛋白质免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。它具有以下优点：①免疫原性强，表达的蛋白接近其天然构象；②可激发体液和细胞的免疫反应，免疫应答持久，且无毒力回升危险；③核酸疫苗具有共同的理化特性，为联合免疫提供可能；④疫苗制备简便，省时省力。

　　现阶段，对艾滋病、 t细胞淋巴瘤等疾病的核酸疫苗研究已进入临床前阶段，乙型肝炎、丙型肝炎、结核病、甲型流感等核酸疫苗已在开发之中。在口腔疾病方面，国内已有学者着手 dNA防龋疫苗的研究。我们（1998）现已成功地用真核表达系统 pSVL与变链菌 pAc结构基因 pac的3.2kb片段构建了变链菌表面蛋白的 dNA疫苗 pSVL／ pac。并在运用计算机 dNA分析软件包对 pac基因进行严格的遗传学背景及分子克隆工程数据分析基础上，进一步设计和论证出构建防龋核酸疫苗的最佳克隆方案，同时选择并得到一种理想的高效真核表达载体系统。该真核表达质粒被认为是当今世界上研究核酸疫苗的最佳载体系统之一，其表达效率为90年代构建核酸疫苗的主要载体之一 pcDNA3的10～40倍，并能在哺乳动物体内持续稳定地表达。以上述工作为基础，一种含全部富丙氨酸区（ a-region）及富脯氨酸区（ p-region）的2．2kbpac基因片段的核酸疫苗即将被构建。利用这一疫苗，我们将全面开展核酸疫苗防龋的各项实验研究工作：包括克隆化 pac基因片段在哺乳动物细胞中的表达，在动物被免疫组织原位及体液中的检测，变链菌粘附的抑制实验及免疫定菌鼠后龋齿发生率变化的观测等一系列实验，这些工作将为人类运用核酸疫苗预防龋病奠定基础。

　　二、被动免疫防龋研究

　　被动免疫是直接应用特异性抗体以中和及对抗特异性致病菌的致病作用。由于可能避免主动免疫某些不能预料的副作用，如不会激发系统免疫反应，不会象系统运用防龋疫苗那样引起心脏交叉反应，因此易为人们所接受并日益受到关注。

　　1．多克隆抗体和单克隆抗体：从80年代末至今，已有大量研究资料证实运用多克隆抗体（简称多抗）和单克隆抗体（简称单抗）被动免疫防龋的有效性。 michalek等（1987）首先尝试了用牛奶中的多抗免疫防龋研究。用变链菌4种血清型全菌抗原免疫奶牛，将获得含特异性抗变链菌抗体的牛奶喂养定菌鼠，结果显示，实验组动物变链菌粘附水平、菌斑指数及龋齿活性均显著性降低。 loimaranta等（1997）研究也证实用变链菌和茸毛链球菌免疫的牛，其初乳中 igG能显著抑制变链菌及茸毛链球菌的葡萄糖代谢和胞外多糖的合成。

　　日本学者则尝试用鸡蛋黄抗体（ yIgG或 igY）被动免疫防龋。 otake等（1991）用灭活的变链菌免疫母鸡，将从鸡蛋黄中提取的 yIgG饲养定菌鼠，使鼠菌斑中变链菌数量显著降低，并有效地控制了龋齿的发生。 hamada等（1991）动物实验则显示，抗细胞结合型葡糖基转移酶（ cAGTase）的 yIgG能有效地阻止致龋菌对大鼠牙面的粘附，抑制龋病的发生。 hatta等（1997）将在含蔗糖培养基上生长的变链菌免疫母鸡获得的 igY与10％蔗糖同时用于自愿受试者漱口，发现短时间内（4h）受试者唾液中变链菌占总链球菌百分率显著下降。

　　单抗用于被动免疫具有高度探索性。自单抗技术诞生以来，已成功地用于解决许多具有重大理论意义和应用价值的生物学问题。用抗变链菌 pAc的单抗免疫实验动物和人类，能有效地抑制宿主口内固有变链菌的再粘附以及外源性变链菌在宿主口内的粘附与定殖。我们的研究（1997）也证实，抗茸毛链球菌表面蛋白 pAg的单抗能显著性抑制定菌大鼠口内茸毛链球菌的粘附，降低龋齿发生率。用单抗被动免疫引人注目的一点是其具有长效作用，即尽管在牙面短期应用，其防龋作用却可持续2年左右。 ma等（1990）推测，这可能由于在口腔微生物间发生了菌群的生态转移，导致对变链菌粘附的抵抗性。

　　关于被动免疫的防龋机制，目前推测单抗和多抗可能是通过影响细菌表面的理化特性如电荷、表面自由能、疏水性等，在体内则可能起调理作用并对细菌的粘附产生影响。但 vanRaamsdonk等（1996）研究发现，单抗对变链菌表面特性的影响不及多抗，且体外研究表明，单抗作用于变链菌，不能象多抗那样刺激多形核白细胞对其吞噬和杀伤作用。

　　另外，将利用基因工程技术构建的各种新型疫苗免疫动物所获得的特异性抗体作被动免疫防龋，是近来免疫防龋的新趋势。 chia等（1993）用变链菌 gTase的含19个核苷酸片段 gTFC435～453与牛血清白蛋白连接免疫小鼠获得抗 gTF多肽的单抗，体外实验显示，能明显抑制 gTFC合成不溶性葡聚糖，并进一步抑制变链菌的蔗糖依赖性粘附。我们最近（1998）运用基因工程技术构建了变链菌 gTF-Ⅰ过度表达株，将其免疫奶牛，测得牛乳中含高水平的抗变链菌抗体。将该免疫牛奶用于自愿受试人群含漱，结果显示，牙舌面变链菌粘附水平显著下降。进一步证实了用多抗被动免疫的可行性。

　　2．新型单抗：随着基因工程技术的不断完善和发展，国外学者已开展将杂交瘤技术与基因工程技术相结合，制备新型单抗的研究，包括双特异性单抗、嵌合单抗、具有其他活性功能区的单抗及单域抗体等。这些新型单抗可以从不同侧面、不同程度克服原有单抗因其自身分子组成特点所致的某些缺陷与不足。其中单域抗体（ single domain antibodies）具有抗体分子小，易于穿透组织，且抗原性弱的特点，很适宜人体内应用。其制备是通过从免疫动物的脾细胞和外周血淋巴细胞中提取 dNA或 mRNA，然后用 pCR技术对已重排的 vH基因进行扩增，将扩增后的目的基因克隆至能分泌的表达性载体中，最后转入大肠杆菌，检测细菌培养上清便可分离纯化单域抗体。

　　单域抗体使利用细菌来生产特异性抗原的小分子抗体成为可能，另外其制备简便，无需组织培养，获得的转化细菌比杂交瘤稳定。因此，对它的基础与应用研究已越来越受到重视。但在口腔医学领域的研究尚未见报道。

　　3．转基因植物：植物具有合成和组装各类抗体分子的能力，包括很小的抗原结合区或片段到整个抗体，甚至多价抗体。植物又具有经济，易于规模化的优点，因此为一理想的表达系统。运用基因工程技术将特异性抗体分子整合至植物基因中，用转基因植物进行局部免疫治疗，是近期备受关注的研究课题。英国科学家 ma等（1995）将抗变链菌表面蛋白单抗的重链与轻链基因克隆并表达于 nicotiana烟草植物中，发现转基因植物能高水平地表达单抗全长抗体分子。近期报道（1998），他们已将这种转基因烟草浸汁被动免疫自愿受试者，显示受试对象龋活性的明显下降，引起举世瞩目。