胎鼠长骨培养模型用于雌激素衍生物抗骨质疏松活性初步筛选

www.cnkang.com 2007-3-23 10:19:00 中华康网

　　【摘要】　目的　为对抗骨质疏松症化合物进行初步药理活性筛选寻找快捷、方便、经济的工具。　方法　取16天胎龄的胎鼠尺骨，置于含BGJ培养基的培养瓶中，分别加入待测雌酚酮、骨靶向新化合物四环素-哌嗪雌酚酮（XW630）及其衍生物四环素-（2-羧酸酯）-哌嗪雌酚酮（ZWI-1），通入CO2、N2和O2混合气体，密闭后在旋转装置上培养48 h，测量骨干长和骨总长，石蜡包埋切片后进行HE染色，光镜下计数破骨细胞和肥大软骨细胞。　结果　待测化合物浓度为10-7mol/L时，与对照组骨干长〔(1.22±0.08)mm〕、骨总长〔 (3.54±0.07)mm〕、破骨细胞〔(12.3±1.5)个〕及肥大软骨细胞〔(10.0±1.0)个〕相比，雌酚酮组、XW630组和ZWI-1组骨干长依次分别增至(1.39±0.09)mm、(1.46±0. 08)mm和(1.49±0.06)mm(均为P＜0.01)。骨总长分别增至(3.76±0.13)mm(P ＜0.05)、(3.77±0.22)mm(P＜0.05)和(3.90±0.12)mm(P＜0.01) 。破骨细胞分别减至(5.3±0.6)个、(6.0±1.6)个和(5.7±0.6)个(均为P＜0.01) 。肥大软骨细胞分别增至(15.3±1.5)个(P＜0.01)、(14.2±1.3)个(P＜0 .05)和(15.6±1.3)个(P＜0.01)。　结论　用该模型可同时观察到化合物对骨吸收和骨形成的作用，可用于雌激素类化合物抗骨质疏松药理活性的快速初筛。

The use of cultured long bones from fetal mice for the primary screening of anti-osteoporosis with estrogen derivatives

LI Lingzhi　ZHANG Yongliang　MA Liying, et al.

　　（Dep artment of Pharmaceutical Chemistry, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041,China）

　　【Abstract】　Objective　To influences estrone, XW630 and ZWI-1 to the growth of cultured long bones of fetal mice were examined in order to find out a proper mo del used for primary quick screening of anti-osteoporosis with estrogen. 　Methods　 Long bones from 16-day-old female mouse fetus were cultured in GBJ medium wit h mixing N2,O2 and CO2 in a rotating device for 48 h, estrone, XW630 and ZWI -1 were added to the culture medium separately. The bones were harvested and then the l ength of bones and their diaphyses were measured. The histomorphormetric analyse s on midlongtigitudinal sections of bones were performed and the number of osteo clasts and hypertrophic chondrocytes were determined. 　Results　When the concentra tion of estrone, XW630 and ZWI-I was at 10-7 mol/L, the length of diaphys eal and bone, and the number of hypertrophic chondrocytes significantly increased compar ed with that of the controls, while the number of osteoclasts significantly decr eased than that of the controls. 　Conclusions　The bone formation and bone resorpt ion can be simultaneously observed, the model can be used for quickly primary sc reening of anti-osteoporosis with estrogen.

　　【Key words】　Osteoporosis，　Estrogens, synthetic;　Osteoclast;　Chondrocytes

　　目前用于观察雌激素类抗骨质疏松症药物疗效所采用的动物模型基本有两类,即去卵巢动物模型和体外骨器官或骨细胞培养模型。为对抗骨质疏松症化合物进行初步药理活性筛选寻找快捷、方便又经济的工具方法，我们于1997年1月至1998年6月采用旋转悬浮式小鼠胚胎长骨体外培养模型观察雌酚酮、骨靶向新化合物四环素-哌嗪雌酚酮(XW630)及其衍生物四环素-(2-羧酸酯)-哌嗪雌酚酮(ZWI-1)对骨生长的影响作用。

　　材料与方法

　　一、实验动物

　　2～3月龄昆明种小鼠，雌鼠体重（30±5）g，雄鼠体重（35±5）g，由四川抗生素研究所动物中心提供。小鼠在温度（24±3）℃、湿度60%～70%条件下，自由摄水摄食。选择健康雌、雄鼠于22时按雌∶雄为2∶1的比例合笼，次日8时检查阴栓，查见阴栓即为交配，定为妊娠0天，妊娠第16天8时定为妊娠第16天。

　　二、方法

　　1.药品与主要试剂：XW630、ZWI-1和雌酚酮由华西医科大学药学院郑虎研究室提供。培养基BGJ、Hepes、胎牛血清（FBS）均购自Sigma公司（美国）。

　　2.主要设备：隔水式恒温培养箱（上海跃进医疗器械三厂），旋转装置〔由微型电动机、铝合金转盘与支架构成（成都方圆电子工程研究所）〕，超净工作台（蚌埠净化设备厂），Olympus解剖显微镜（日本），Olympus显微镜(日本)，组织切片机（AO,美国），THW-500型真彩色图像分析系统(四川联合大学图像研究所)。

　　3.组织培养及观察：培养基的配制：将培养基BGJ溶于高压灭菌的双蒸水中，加入3.5 g碳酸氢钠和5.1 g Hepes，定容至1 L，正压除菌过滤后分装于无菌瓶，贮存于4℃冰箱备用。临用前加入10%FBS、150 μg/ml维生素C、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，调节培养基的pH为7.2。实验分组：实验分为XW630组、ZWI-1组、雌酚酮组和正常对照组。除正常对照组外，其他3组给药浓度分为10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol /L。每组培养长骨6根，重复5次。培养方法：将16天孕龄的小鼠脱颈椎处死，取出子宫，放入盛有Hank's液的培养皿中，分离胚胎，剪取雌性胎鼠前肢，于解剖显微镜下剥离肌肉及软组织，游离出尺骨共300根，并转移到盛有BGJ培养基的培养皿中。用滴管将尺骨转入培养瓶，按实验分组加入待测药物，置旋转装置上，通入O2∶CO2∶N2比例为45%∶5%∶50%的混合气体，气流量1.5 L/min，于（37.5±0.5）℃旋转培养，转速为35 r/min。24 h后补充气体1次，每次通气1 min。

　　骨干及骨总长度的测量：将培养48 h的尺骨转移至培养皿中，在带游标标尺的解剖显微镜下测量其骨总长度及骨干长度。组织学观察：将培养48 h的骨组织在4%多聚甲醛磷酸缓冲液（pH 7.2）中固定后，用7%EDTA磷酸缓冲液（pH 7.2，4℃）脱钙，其间每天更换EDTA磷酸缓冲液1次，16天后，将骨组织用双蒸水漂洗，逐级酒精脱水，石蜡包埋，纵切成5 μm厚切片，HE染色，二甲苯透明，封片。显微镜下对破骨细胞及肥大软骨细胞进行计数。

　　三、统计学方法

　　所得数据用均数±标准差(±s)表示,并进行方差分析和q检验。

　　结　果

　　解剖显微镜下可见长骨清晰地分为软骨区和骨化区。由HE染色切片可见软骨区分为静止区、增殖区和肥大区。骨干可见间质细胞，肥大区软骨细胞出现去分化迹象，间质组织之间可见许多腔隙及少量破骨细胞。各实验组骨干、骨总长测量结果及破骨细胞、肥大软骨细胞计数结果见表1。

表1　雌酚酮、XW630和ZWI-1对小鼠长骨的影响

组别药物浓度

　　(mol/L)
尺骨数

　　(根)
骨干长

　　(mm)
骨总长

　　(mm)
破骨细胞

　　(个/每张切片)
肥大软骨细胞

　　(个/每张切片)

对照组　 18 1.22±0.08 3.54±0.07 12.3±1.5 10.0±1.0
雌酚酮 10-7 18 1.39±0.09** 3.76±0.13* 5.3±0.6** 15.3±1.5**
10-8 18 1.23±0.07 3.61±0.15 6.0±1.7* 10.3±1.5
10-9 18 1.22±0.12 3.62±0.07 10.3±1.5 10.3±2.5
XW630 10-7 18 1.46±0.08** 3.77±0.22* 6.0±1.6** 14.2±1.3*
10-8 18 1.33±0.06* 3.73±0.17 7.7±3.0* 13.5±1.9
10-9 18 1.21±0.08 3.63±0.12 9.7±2.5 12.7±0.6
ZWI-1 10-7 18 1.49±0.06** 3.90±0.12** 5.7±0.6** 15.6±1.3**
10-8 18 1.31±0.09 3.64±0.10 7.7±1.5* 16.0±2.6**
10-9 18 1.25±0.10 3.50±0.20 8.0±1.0* 13.4±1.8*

　　注：与对照组相比,P＜0.05,P＜0.01　　由表1可以看出：当给药浓度为10-7mol/L时，培养48 h后3个给药组骨干和骨总长的增长速度均高于对照组，低于10-7mol/L时，与对照组差异无显著性意义。

　　给药浓度为10-7mol/L时，培养48 h后，3种化合物均可使长骨破骨细胞数目减少，肥大软骨细胞数目增加。XW630和ZWI-1则分别于10-8mol/L

　　和10-9mol/L仍可表现出此作用。低于10-7mol/L时，雌酚酮组与对照组差异无显著性意义。

　　讨　论

　　临床研究表明,体内雌激素缺乏常会引起过量骨丢失，绝经后妇女服用雌激素可以降低此种骨丢失，因此被用于治疗骨质疏松症,其药理学基础是雌激素能够促进骨形成,抑制骨吸收，从而促进骨生长。

　　破骨细胞在骨吸收过程中起主要作用，它对骨的吸收活动相当活跃，可以从一个部位游走到另一个部位，施行其破骨活动，一个破骨细胞可以溶解吸收由100个成骨细胞所形成的骨质〔1〕，所以，破骨细胞数目的变化是观察骨吸收程度的一个最直接的指标。有文献报道，雌激素可以抑制去卵巢小鼠由于雌激素水平下降所致的破骨细胞发育过度以及椎骨破骨细胞数目增加〔2〕。

　　在软骨内成骨的过程中，软骨细胞的分化特点是经过一系列形态学变化变肥大。研究表明肥大软骨细胞也表达骨钙素(osteocalcin)、骨桥蛋白(osteopontin)和骨涎蛋白(bone　sialorotein)，而这3种蛋白以前一直被认为仅仅由成骨细胞表达；研究还显示在软骨内成骨的过程中，肥大软骨细胞在功能上与成骨细胞、血管细胞和破骨细胞的生成相偶联〔3〕，其数目变化在一定程度上可以反映软骨细胞分化和骨形成的情况。

　　成骨细胞〔4〕、破骨细胞〔5,6〕和软骨细胞〔7〕均存在雌激素受体，雌激素可在体外通过受体介导机制直接作用于骨组织。本实验结果显示：雌酚酮给药浓度为10-7mol/L时,可促进骨形成,抑制骨吸收；给药浓度为10-8mol/L时，仅可抑制骨吸收；10-9mol/L时,则对骨生长无影响。结果表明雌酚酮对骨生长的影响与浓度有关，与文献报道的雌激素作用特点一致。XW630是雌酚酮与四环素经哌嗪桥环通过Mannich反应所得的耦联物，药理学实验已证实该化合物对成骨细胞DNA合成和基质蛋白合成均具有明显的促进作用，对大鼠骨质疏松症模型表现出促进骨形成的作用，在10-6～10-9mol/L范围内，此作用呈剂量依赖性降低〔8,9〕；ZWI-1是XW630结构类似物，从化学及立体结构推测其可能具有与XW630相似的作用。在实验中，两个化合物均表现出与雌酚酮同样的促进骨生长作用,当给药浓度不低于10-7mol/L时，可以直接观察到二者对培养长骨生长发育的影响，表明使用该模型的观察结果是可靠的。

　　Schwartz等〔10〕1985年利用CO2孵箱建立了小鼠胚胎长骨体外培养模型，并于1991年采用该模型观察了雌激素和雄激素对长骨生长发育的影响，发现培养48h后可观察到雌二醇和睾丸酮对骨生长的明显促进作用,并呈性别依赖性。我们将Schwartz模型由固定悬浮式培养改进为旋转悬浮式培养，使培养环境更接近体内动态状况，并克服了骨组织粘附生长在滤膜上的缺点,同时还由于封闭培养而减少了污染。利用浸没式一次通气旋转装置，可用隔热恒温培养箱代替价格昂贵的CO2孵箱，更加方便、经济。

　　实验结果提示：利用该模型观察雌激素类化合物对骨组织的药理活性，浓度适当时，48h后即可直观地观察到化合物对骨生长的影响情况，结合组织学观察，能较准确地从骨吸收和骨形成两方面反映化合物对骨的药理作用，可用于雌激素类化合物抗骨质疏松症药理活性的快速初筛，进一步缩小了采用骨质疏松症动物模型进行筛选的范围。

　　基金项目：国家自然科学基金重点项目资助课题（39430120）

　　参考文献

　　1，刘忠厚. 骨质疏松症. 北京:化学工业出版社, 1992.33-210.

　　2，Jillca RL, Hangoc G, Girasole G, et al. Increased osteoclast developme nt after estrogen loss: mediation by interleukin-6. Sciences,1992,257:88-91.

　　3，Gerstenfeld LC, Shapiro FD. Expression of bone-specific genes by hypertrophic c hondrocytes: implication of the complex functions of the hypertrophic chondrocyt es during endochondral bone development. J cell Biochem, 1996,62:1-9.

　　4，Bodine PVN , Herderson RA, Green J, et al. Estrogen receptor-α is developmenta l ly regulated during osteoblast differentiation and contributes to selective resp onsiveness of gene expression. Endocrinology, 1998, 139: 2048-2057.

　　5，Mano H, Yuasa T, Kameda T, et al. Mammalian mature osteoclast s as estrogen target cells. Biochem Biophys Res Comm,1996,223:637-642.

　　6，Kameda T, Mano H, Yuasa T, et al. Estrogen inhibits bone resorption by directly inducing apoptosis of the bone-resorbing osteoclasts. J Exp Med, 1997,186:489 -495.

　　7，Ben-Hur H, Thole HH, Mashiah A, et al. Estrogen, progesterone and testosterone receptors in human fetal cartilaginous tissue: immunohistochemical studies. Calc if Tissue Int, 1997,60:520-526.

　　8，郑虎，翁玲玲. 可用作带有雌激素结构的骨靶向药物的化合物〔P〕.中国专利：1997.94111687，1997-05-21.

　　9，Zheng H, Weng LL. Bone resportion inhibition / osteogenesis p romotion pharmaceutical composition〔P〕. USP:5698542,1997-12-16.

　　10，Schwartz Z, Soskilne WA, Neubauer T. Direct and sex-specific enhancement of bo ne formation and calcification by sex steroid in fetal mice long bone in vitro (biochemical and morphometric study). Endocrinology , 1991,129:1167-1173.