前列腺增生症各区细胞增殖与凋亡特征的研究

　　【摘要】　目的　探讨良性前列腺增生症(BPH)各区细胞增殖 和凋亡特征及其与BPH发病的关系。　方法　采用流式细胞术对33例 BPH病人前列腺各区细胞表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGF-R)、碱性纤维细胞生 长因子(bFGF)和转化生长因子-β1 (TGF-β1) 表达、细胞DNA含量和细胞凋亡情况进 行定量对比分析。　结果　EGF和EGF-R的标记率和表达量在移行区(TZ )明显高于周边区(PZ)和中央区(CZ)(P均＜0.01)。bFGF和TGF-β1的标记率在三个区 差异无显著性(P＞0.05)，而bFGF和TGF-β1的表达量在TZ明显高于PZ和CZ(P均＜0 .01)。TZ细胞增殖指数(PI)明显高于PZ和CZ(P＜0.01)；各区细胞凋亡率差异无显著性。　结论　TZ细胞中EGF、EGF-R、bFGF和TGF-β1高表达和高增殖活 性是BPH发病的重要因素，细胞凋亡与BPH发生特征无明显相关。

A study of the characteristics of cellular proliferation and apoptosis in differ ent zones of benign hyperplastic prostates

CAI Wenqing, LING Yiling, LI Wei, et al.

　　（Department of Urology,2nd Affiliated Hospital, Hebei Medical Univer sity, Shijiazhuang 050000,China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the characteri stics of cellular proliferation and apoptosis in different zones of benign hyper plastic prostates(BPH).Methods　With the use of flow cytomet ry (FCM),the cellular DNA content,the apoptosis and the expression of the epider mal growth factor (EGF), epidermal growth factor receptor (EGF-R), basic fibrob last growth factor (bFGF), transforming growth factor β1(TGF-β1) of the c ells in different zones of the prostates of 33 BPH patients were quantitatively a ssessed.　Results　The marked rates and expression volumes of EGF and EGF-R were significantly higher in TZ than PZ and CZ (P＜0.01).T here was no difference among three zones in marked rates of bFGF and TGF-β1( P＞0.05),whereas expression volumes of bFGF and TGF-β1 were significantly higher in TZ than PZ and CZ(P＜0.01).Proliferation index (PI) of TZ cells we r e significant higher than those of PZ and CZ(P＜0.01).There was no significa nt difference among the cellular apoptosis rates of different zones.　Conclusions　Increased expression of EGF,EGF-R, bFGF and TGF-β1 and higher proliferation activity in the TZ were considered to be important fa ctors in the pathogenesis of BPH. There was no significant relevant between cell ular apoptosis and the occurrence of BPH.

　　【Key word】　Prostatic hypertrophy　　Cytology

　　前列腺增生症(BPH)是老年男性常见病。迄今为止，BPH的病因和发病机理尚不十分清楚。解剖学上习惯将前列腺分为5叶，即前叶、中叶、后叶及左右两侧叶。1972年McNeal将前列腺功能、病理变化与形态学联系起来，对前列腺各部作了新的命名，将其分为周边区(per ipheral zone,PZ)，移行区(transitional zone,TZ)和中央区(central zone,CZ)。并提出周边区为前列腺癌最常发生的区域，而移行区则是前列腺增生症发生的唯一部位［1］。这一理论已经得到多数学者的认可［2，3］。为了探讨增生只发生在移行区的原因，我们以FCM方法对三个区细胞的表皮生长因子(EGF)及其受体(EGF-R)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达及细胞增殖活性和凋亡情况进行了对比检测。

　　材料和方法

　　一、病例及取材方法

　　33例BPH前列腺标本取自经膀胱前列腺摘除术的患者,光镜病理证实为BPH。年龄58～83岁，平均66岁。取出前列腺后立即按McNeal解剖分区取材(即在前列腺后窝处剪取两块假被膜，上方近膀胱颈处一块为中央区组织，下方近尿道处一块为周边区组织，在摘除的前列腺增生明显结节处取移行区组织)［1，4］，分别用70%酒精固定，4℃冰箱保存。

　　二、单细胞样品制备

　　将标本用生理盐水冲洗后，搓网法制备单细胞样品。收集细胞悬液，500～800r/min离心沉淀2min，用生理盐水离心洗涤2次，置0～4℃冰箱备检。

　　三、免疫荧光检测

　　1．试剂：(1)EGF,克隆144-8，鼠抗人单抗，效价1∶100。(2)EGF-R,克隆1005，鼠抗人单抗,效价1∶100。(3)bFGF,克隆147-G,兔抗人多克隆抗体,效价1∶50。(4)TGF-β1，克隆V，兔抗人多克隆抗体，效价1∶50。(5)羊抗鼠(二抗) FITC-IgG，羊抗兔(二抗)FITC-I gG。以上试剂均为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品。

　　2．免疫荧光染色：采用间接标记法对前列腺不同区域的87个样品进行免疫荧光染色，上机检测前加入1mlPBS液，经400目筛网过滤，即上机分析。同时设有(1)PBS代替一抗的阴性对照，(2)只加一抗的阳性对照，(3)只加1∶100FITC-IgG(二抗)的阳性对照，(4)用小鼠血清或兔血清的同型对照。

　　四、DNA染色

　　采用碘化丙啶一步荧光染色法对33例前列腺组织的99份不同区样品进行细胞DNA染色［5］。

　　五、FCM检测

　　应用FACS-420型流式细胞仪进行检测。数据和图像送入HP-300 Consort 30计算机，应用相应的程序软件分别进行资料处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器的CV值在5%以内。以细胞标记率和表达量表示生长因子及其受体的表达状态，以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性；以亚二倍体DNA含量细胞的比率表示细胞的凋亡情况。

　　六、统计学处理

　　采用秩和检验。

　　结　　果

　　一、前列腺三个区域细胞生长因子的表达

　　1．三个区中三种生长因子和EGF-R的标记率：(1)EGF的标记率TZ(24.10%)明显高于PZ(16.50%))和CZ(12.90%),P值均＜0.01,PZ与CZ相比较差异无显著性，P＞0.05；(2)EGF-R的标记率TZ(19.80%)明显高于PZ(14.00%)和CZ(15.50%)，P均＜0.01，PZ与CZ相比较差异无显著性，P＞0.05；(3)bFGF的标记率PZ、TZ和CZ三个区分别为16.40%、22.50%和18.80%，三个区比较差异无显著性，P＞0.05；(4)TGF-β1的标记率在PZ、TZ和CZ分别为15.20%、22.60%和15.80%，三个区 相比较差异无显著性，P＞0.05。

　　2．三个区中三种生长因子和EGF-R的表达量：(1)EGF的表达量TZ(76.99pg)明显高于PZ (49.00pg)和CZ(50.99pg), P＜0.01，PZ与CZ的表达量相比较无统计学差异，P＞0.05 ；(2)EGF-R的表达量TZ(70.00pg)明显高于PZ(48.00pg)和CZ(49.00pg)，P均＜0.01，PZ 和CZ相比较无统计学差异，P＞0.05；(3)bFGF的表达量TZ(68.98pg)明显高于PZ(44.96 pg)和CZ(44.96pg), P均＜0.01，PZ和CZ相比较无统计学差异，P＞0.05；(4)TGF-β 1的表达量TZ(61.98pg)明显高于PZ(46.00pg)和CZ(50.00pg)，P均＜0.01，PZ和CZ相比 较在统计学上无差异，P＞0.05。

　　二、BPH三个区细胞增殖和凋亡情况

　　TZ的细胞S期比率和增殖指数均明显高于PZ和CZ，P均＜0.01，而后二者细胞增殖活性差异无显著性。FCMDNA含量亚二倍体峰的定量检测结果显示，三个区域细胞的凋亡率差异无显著性(表1)。

　表1　不同区细胞的增殖及凋亡情况(中位值，n=33)

分区 S期比率(%) PI(%) 细胞凋亡率(%)
PZ 6.80 13.80 2.40
TZ 9.90* 19.50* 　2.10**
CZ 7.10 14.00 2.00

　　*P＜0.01，**P＞0.05（与PZ和CZ比较）讨　　论

　　EGF是一种相对分子质量为6000，有53个氨基酸残基的细胞调节多肽。EGF对前列腺上皮细胞有促分裂作用，其活性由饱和的高亲和力的膜上受体调节。EGF在前列腺本身的机能可能是调节平滑肌收缩，促进细胞增殖，维持pH稳定和膜离子的流动［6］。EGF-R是一种相对分子质量为170000、具有磷酸化功能的跨膜蛋白。EGF与其受体结合后可激活受体的酪氨酸激酶，导致受体本身及细胞内酪氨酸残基磷酸化，从而启动RNA、DNA和蛋白质的合成，最终导致细胞有丝分裂和增殖。免疫组化和生化方法已证实前列腺组织中存在EGF-R，其染色阳性率在前列腺癌为17%，而BPH高达88%，并发现在BPH的基底细胞中含量最高［7］。

　　bFGF为146个氨基酸的蛋白质，是一种有效的间质细胞有丝分裂源和血管生成因子，也是BPH发生中间质-上皮相互作用的重要调节因子，在前列腺基底上皮细胞的胞浆内有很强的表达，在BPH中的含量比正常前列腺高2～3倍，尿道周围的浓度最高。通过bFGF的检测可预料前列腺的早期改变［3，8］。

　　正常情况下，EGF和TGF-β1在前列腺上皮细胞的作用是对抗性的，EGF在增生方面起刺激作用，而TGF-β1起抑制作用，两种因子相互作用维持前列腺细胞的平衡［3］。Marilyn等［9］在前列腺癌细胞培养中发现了一种罕见现象，即TGF-β1对前列腺癌细胞系TSU-Pr1起刺激增殖作用，并认为TSU-Pr1是一种特殊的细胞系，不但不被TGF-β1所抑制，反而促进增殖。

　　许多学者认为BPH的发生是由雌、雄激素失衡，凋亡、抗凋亡基因及增殖基因的异常表达，间质-上皮相互作用和生长因子的刺激等综合因素引起。雄激素通过影响细胞增殖率和凋亡率来调节上皮细胞的数量，并发现BPH上皮细胞中的细胞动力学是平衡的，即增殖指数和凋亡指数相等，而间质中只有增殖而缺乏凋亡。BPH的发生很可能是细胞增殖和凋亡之间的失衡而引起。也就是说，存在两种可能，一是细胞增殖活性增强，而凋亡没有改变；二是细胞增殖活性没有改变，而凋亡降低，最终导致BPH［10］。

　　本研究结果表明，在发生BPH的移行区中EGF、EGF-R、bFGF和TGF-β1的表达量明显高于周边区和中央区；同时分析表明三个区细胞凋亡率无明显差别，而移行区细胞的增殖率明显高于周边区和中央区，并主要表现为移行区S期增殖率明显增高，说明移行区细胞的DNA复制及有丝分裂高于周边区和中央区。结果提示，BPH的发生主要是由于EGF、EGF-R、bFGF、TGF-β1等因子高表达长期刺激引起细胞的异常增殖，最终导致前列腺的过度增长而产生，与细胞凋亡没有显著的因果关系。值得提出的是，本研究发现TGF-β1在移行区也有高表达，这种因子本来是细胞增殖抑制因子，它的高表达应该抑制细胞增殖，以防止BPH的发生，但结果并非如此。我们认为对这种矛盾结果可能的解释是：(1)BPH组织对TGF-β1的反应与正常前列腺组织不同，或细胞上的受体有差别，可能与TSU-Pr1细胞系的受体有相同之处，TGF-β1与其结合后，不但不能抑制增生，反而起到刺激增生的作用；(2)EGF和bFGF的联合作用大于TGF-β1的作用，尽管TGF-β1有高表达，但也不能抑制EGF和bFGF的促增生作用；(3)bFGF和TGF-β1在前列腺组织中有一个相对恒定的比例，这个比例一旦被破坏，就可引起增生。总之，这些生长因子在BPH的发生中是一个重要因素，但哪个或哪些因子是启动因子、它们之间及其与其它因子之间的相互关系有待进一步研究。

　参考文献

　　1，彭轼平.前列腺增生症.见：吴阶平主编.泌尿外科.第1版.山东:山东科学技术出 版社.1993,938-948.

　　2，Kyprianou N,Litvak J, Borkowski A, et al. Induction of prostate apoptosis by doxazosin in benign prostatic hyperplasia.J Urol,1998 159:1810-1815.

　　3，Deshmukh N, Scotson J, Dodson AR, et al. Differential expression of acidic an d basic fibroblast growth factors in benign prostatic hyperplasia identified by immunohistochemistry.Br J Urol, 1997,80:869-874.

　　4，郭应禄.前列腺增生症及前列腺癌.第1版.北京:人民卫生出版社.1998,19-24.

　　5， 左连富.流式细胞术样品制备技术.第1版,北京:华夏出版社.1991,49-51.

　　6，Jackson E,Fowler JR,James LT Lau,et al.Epidermal growth factor and prostatic carcinoma:an immunohistochemical study.J Urol,1988,139:857- 861.

　　7，Grorge KI,Billie Jo MK,James AM,et al.Differential immunoreactivity of epid ermal growth factor receptor in benign,dysplastic and malignant prostatic tissue s.J Urol,1993,149:170-173.

　　8，Frank PB,Michael TS,Kathleen AP,et al.Regional concentration of basic fibro blast growth factor in normal and benign hyperplastic human prostates.J Urol,199 5, 153:839-843.

　　9，Marilyn LG,Lamm,Sharon MS,et al.A proliferative effect of transforming grow th factor-β1 on a human prostate cancer cell line TSU-Pr1.Endocrinology,19 98,139:787-790.

　　10，Colombel M,Vacherot F,Diezs G, et al.Zonal variation of apoptosis and proliferation in the normal prostate and in benign prostatic hyperplasia. Br J Urol, 1998,82:380-385.