器官移植HLA-IgG抗体测定方法的比较研究

　　【摘要】　目的　评价酶联免疫法和细胞毒法在器官移植方面的应用价值。　方法　采用酶联免疫法(LATM、LAT、STAT)和细胞毒法( lCT)检测211份血清样本HLA抗体，比较其特异性与敏感性，分析三组肾移植受者的致敏状态。　结果　除2份STAT测定无结果外，其他样本均获有效结果。与LATM比较，LAT特异性97.9%、敏感性100.0%、重复性100.0%、变异系数(CV)=5.2%～8.9%；ST aT特异性92.6%、敏感性90.6%、重复性94.0%、CV=7.3%～12.6%；LCT特异性88.4%、敏感性89.6%、重复性90%、CV=8.1%～15.4%。移植肾失功者HLA抗体致敏率超过80.0%，首 次尸肾移植术前致敏率20.0%、术后略有升高(27.0%～31.7%)。　结论　酶联免疫法测定HLA-IgG抗体，特异性与敏感性高、重复性好，适合于国内器官移植临床应用。推荐采用LATM定性筛选、LAT定量分析

A comparative study of different methods for the detection of a nti-HLA-IgG antibodies in organ transplantation

TAN Jianming,TANG Xi aoda,ZHOU Yongchang.

　　(Renal Transplantation Center,Fuzhou General Hospital of PLA, Fuzhou350025,China)

　　【Abstract】　Objective　To evaluate some methods in the d etection of HLA-IgG antibodies in organ transplantation.　Methods　HLA-IgG antibodies in 211 sample s of serum were detected by means of ELISA including LATM,LAT and PRA-STAT or b y microlymphocytotoxicity(CDC)with LCT.Specificity and sensitivity of the 4 meth ods were compared.　Results　The assay has been successful either by ELISA or CDC except in 2 samples by STAT.The specificity and sensitiv ity of LAT assay as compared with LATM was 97.9%～100% and the reproducibility 1 00% with CV=5.2%～8.9%.For sTAT assay,the specificity was 92.6% and sensitivity 90.6% with a reproducibility of 94.0% and CV=7.3%～12.6%.The specificity of LCT assay was 88.4%,the sensitivity 89.6% and the reproducibility90.0% with CV=8.1% ～15.4%.Sensitization was over 80.0% in retransplants with hemodialysis and 20.0 % in patients before transplantation for the first time.Sensitization slightly e levated(27.0%～31.7%) in po st-transplants.　Conclusions　ELISA has been more specifi c and sensitive in detecting IgG anti-HLA antibodies with well reproducibility and is recommended for clinical application in organ transplantation.Qualitative screening by LATM and quantitative analysis by LAT were recommended.

　　【Key words】　Transplantation immunology　　Antibody

　　近年酶联免疫法(ELISA)测定人类白细胞抗原(HLA)Ⅰ、Ⅱ类IgG抗体(简称HLA-IgG)取得重要进展。为评价在我国器官移植临床实际应用价值，我们对三种ELISA法和补体依赖性细胞毒法(CDC)进行了比较研究。报道如下。材料与方法

　　一、样本

　　移植肾失功恢复血透者85例份，其中首次移植失功56例、第二次移植失功26例、第三次移植失功2例，恢复血透时间为3个月～6年；首次尸肾移植术前和术后1周至1个月血清各63份，共计211份。采集外周血3ml，分离血清，置-80℃保存至测定。

　　二、测定方法

　　1.美国莱姆德混合抗原板(LATM)和莱姆德抗原板(LAT)检测：依据ELISA原理，采用不同的HLA抗原包被泰萨奇板，通过与样本血清中抗HLA-IgG抗体结合而特异性检测出HLA-IgG［1］。采用Bio-Tek800NB型酶标仪，波长630nm。

　　2.PRA-STAT检测：将HLA抗原包被到普通96孔酶标板，以特异性检测出HLA-IgG［2］。采用普通酶标仪，主波长490nm、参考波长630nm。

　　3.补体依赖性细胞毒方法［3］：采用莱姆德公司细胞板(LCT)，将表达不同的HLA-I类抗原活的淋巴细胞包被Terasaki板并冷冻制成细胞板，根据补体介导的抗原抗体反应原理，染色后在显微镜下观察死亡淋巴细胞的比例以判断抗体水平。

　　三、结果分析

　　1.LATM和LAT检测根据附带计算机软件分析测定结果。

　　2.LCT方法设定阳性值为淋巴细胞死亡数≥40%(评分4分)。

　　3.PRA-STAT：计算cutoff值(平均阳性值×0.35)，当Δ值(测定孔-样本空白对照)＞cutoff值时为阳性，计算%PRA=阳性孔÷46×100%。

　　4.当PRA值＞10%时，分析抗体的特异性。

　　5.以LATM结果比较LAT、PRA-STAT和LCT结果的相符率(特异性和敏感性)。

　　四、统计学处理

　　χ2检验。

　　结　　果

　　一、有效测定结果

　　2份PRA-STAT检测因空白对照A值太高无法计算，其他均获有效测定结果。当PRA＞80%时，因广泛致敏多数难以分辩出抗体特异性。

　　二、HLA-IgG抗体测定结果

　　211份样本中Ⅰ、Ⅱ类抗体均阳性59份，Ⅰ类抗体阳性36份，Ⅱ类抗体阳性10份，阴性106份。各种方法的测定结果见表1。其中LAT方法可准确分辨出抗体的特异性。如980826号样本，Ⅰ类PRA60.0%、Ⅱ类PRA0%，抗体特异性为：A32，A11，A30；970907样本，Ⅰ类PRA3.5%、Ⅱ类PRA25.0%，抗体特异性为：DR53；990061号样本，Ⅰ类PRA50.0%、Ⅱ类PRA66.7%，抗体特异性为：A68，A1，A33，B42，Cw9，DQ5，DQ2。

　表1　LATM与LAT、STAT、LCT检测HLA抗体结果比较

LATM结果 例数 LAT-Ⅰ类 LAT-Ⅱ类 PRA-STAT LCT
 
＜10% ＜80% ≥80% ＜10% ＜80% ≥80% ＜10% ＜80% ≥80% 无结果*
＜10%
 
＜80%
 ≥80%
Ⅰ类+/Ⅱ类+ 　59 　1 22 36 　0 24 35 　1 33 24 1 　4 31 24
Ⅰ类+/Ⅱ类- 　36 　1 19 16 　34 　2 　0 　7 28 　3 0 　7 23 　6
Ⅰ类-/Ⅱ类+ 　10 　10 　0 　0 　0 　6 　4 　1 　9 　0 0 　6 　4 　0
Ⅰ类-/Ⅱ类- 106 106 　0 　0 105 　1 　0 　96 　9 　0 1 　95 11 　0
合　　计 211 118 41 52 139 33 39 103 79 27 2 112 69 30

　　*2份样本，PRA-STAT空白血清对照A值超过3.0，无法计算结果　　三、方法学比较结果

　　1.LAT与LATM结果比较：Ⅰ类抗体特异性97.9%、敏感性100.0%；Ⅱ类抗体特异性100.0%、敏感性97.9%。

　　2.PRA-STAT与LATM比较：Ⅰ类抗体特异性92.6%、敏感性90.6%。PRA-STAT难以判断Ⅱ类抗体的检测结果。

　　3.LCT与LATM比较：Ⅰ类抗体特异性88.4%、敏感性89.6%。LCT无法检测Ⅱ类抗体。

　　四、三组肾移植受者HLA抗体阳性比较结果见表2

表2　ELISA与CDC方法检测三组肾移植受者HLA抗体结果比较

分组 例数 LATM LAT STAT LCT
阳性 致敏率(%) 阳性 致敏率(%) 阳性 致敏率(%) 阳性 致敏率(%)
移植肾失功组 85 75 88.2 74 87.1 70 82.4 66 77.6
首次移植术前 63 13 20.6 14 22.2 17 27.0 13 20.6
移植术后 63 17 27.0 18 28.6 19 30.2 20 31.7
合计 211 105 　 106 　 106 　
99
 　

　　五、重复性试验

　　阳性血清和阴性血清各5份，重复5次，LATM重复性100.0%；LAT阳性率重复性100.0%、PRA值变异系数(CV)=5.2%～8.9%；STAT阳性率重复性94.0%、CV=7.3%～12.6%；LCT阳性率重复性90.0%、CV=8.1%～15.4%。

　　讨　　论

　　根据美国器官分享联合网(UNOS)近期对57303例肾移植的分析，致敏受者(PRA＞10%)术后排斥率与移植物功能延迟恢复明显增加，存活率明显低于非致敏者。作为影响移植物存活的主要因素之一，检测HLA抗体已作为实质性器官移植术前的常规措施，越来越受到临床的重视与关注［4］。

　　目前，PRA检测可分三大类。一类是CDC方法［3］，国外80年代已广泛应用于临床。国内1991年报道采用随机多次淋巴毒试验筛选致敏受者［5］，1993年报道采用冷冻淋巴细胞检测群体反应性抗体［6］，1996年开始引进LCT技术。第二类是采用流式细胞仪技术检测HLA抗体。第三类是ELISA方法，包括PRA-STAT技术［2］和LAT与LATM［1］。该方法可特异性检测与器官移植密切相关的HLA-IgG抗体而不受其他抗体的干扰，可以确定致敏状态和分辩出抗体的特异性。测定方法稳定，结果重复性好，临床应用方便。国内于1998年引进LAT技术，获得较好的结果。

　　我们采用ELISA与CDC方法对汉族人群HLA抗体进行筛选比较，提出适合我国器官移植的PRA检测方法。211份样本测定结果显示：ELISA和CDC方法均有较好的相符率和重复性，尤以LATM和LAT结果最好，STAT次之。其中LATM作为筛选大样本受者，快速、简捷，价格低廉，可同时检出Ⅰ类和Ⅱ类抗体，但不能确定抗体水平和分辨特异性。LAT快速、准确，既可确定抗体水平又可准确分辨其特异性，但价格较昂贵。PRA-STAT类似于LAT，但对Ⅱ类抗体的分辨和确定存在一定的困难，个别情况下，空白对照太高导致检测失败。LCT只能检测出Ⅰ类抗体且存在一定的假阴性和假阳性，尤其是所需要的活淋巴细胞运输与保存不便。因此，从我国器官移植实际情况出发，检测HLA-IgG抗体建议先采用LATM作为筛选性试验，对于抗体阳性的受者，再用LAT或PRA-STAT确定抗体水平和分辨抗体的特异性。

　　本课题受国家卫生部科研基金(962289)和中国博士后科学基金资助

　参考文献

　　1，Wang g,Tarsitani C,Denham S,et al.A new micro-Elisa for anti-clas s Ⅰ and class Ⅱ antibody detection.Human Immunol，1998,59∶133-135.

　　2，Buelow R,Mercier I,Glanville L,et al.Detection of panel reactive anti-HLA class Ⅰantibodies by ELISA assay or lymphocytotoxicity:results of a blinded,con trolled multicenter study.Human Immunol,1995,44∶1-11.

　　3，Hopkins KA.The basic microlymphocytotoxicity assay.In:Zachary AA,Teresi GA. eds.The ASHI laboratory manual.2nd edition.Lenexa.ASHI.1990,195.

　　4，Terasaki PI,Cho Y,Takemoto S,et al.Twenty-year follow-up on the effect of hLA matching on kidney transplant survival and prediction of future twenty-yea r survival.Transplant Proc,1996,28∶1144-1145.

　　5，赵明,吴卫真,张仰奎,等.随机多次淋巴毒试验筛选尸体肾移植受者的临床意义.中华泌尿外科杂志,1991,12∶341-342.

　　6，肖露露,肖巧珍,张仕光,等.群体反应性抗体(PRA)检测--附180例报告.中国免疫学杂志,1993,9∶249-250.