精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系

　　【摘要】　目的　探讨精子MTCYB基因缺失与男性不育的关系。　方法　应用PCR技术对100例不育男性(精子活动力差50例，精子活动力正常50例)和30例已育男性的精子MTCYB基因进行检测。　结果　男性不育组精子MTCYB基因缺失率为16％，其中精子活力差的50例标本检出9例，精子活动力正常的50例标本中检出7例，经统计学检验二组差异无显著性(P＞0.05)。生育组30例精子标本中未检出MTCYB基因缺失，与男性不育组比较差异有非常显著性(P＜0.01)。　结论　MTCYB基因缺失可能是男性不育的原因之一。

Deletion of mTCYB gene and male infertility

CUI Yingxia, WANG Yongmei,SHANG Xuejun,et al.

　　(Center of Medical Laboratory Science,Nanjing General Hospital of PLA,Nanjing210002,China)

　　【Abstract】　Objective　To clarify the deletion of MT CYB gene in male infertility.　Methods　MTCYB gene in sper matozoa was studied by means of PCR in 50 infertile males with poor sperm motili ty and in 50 infertile males with normal sperm motility.30 fertile males served as controls.　Results　MTCYB deletion in spermatozoa was o bserved in 16 of the 100 infertile males,9 being in the infertile males with poo r sperm motility and 7 in the normoal motility group(P＞0.05).No such delet ion was observed in all the 30 fertile males(P＜0.01).　Conclusi ons　Deletion of MTCYB gene in spermatozoa might play a role in male infertility.

　　【Key words】　Infertility,male　　Genes

　　精子活动力障碍是男性不育的重要原因之一。近年来精子活动力障碍及男性不育与线粒体DNA(mtDNA)缺失的关系引起人们的关注。我们为此进行了mtDNA编码的精子MTCYB基因的检测工作，报告如下。

　　材料与方法

　　一、样本选择

　　不育男性100例。年龄28～37岁。手淫法留取精液标本。精液常规检查精子密度10～30×109/L。按活动率不同分为二组，每组各50例。一组为精子活力A+B＞50％，活动率＞70％。另一组活力A+B＜30％，活动率＜35％，此组病人标本经伊红Y染色，确定70％以上为活精子。30名正常已育男性，年龄29～36岁，精液常规检查正常，精子密度＞20×109/L，活动力A+B＞50％，活动率为70％～75％。

　　二、精子mtDNA提取

　　将精子密度调整至10×109/L，按文献〔1〕方法提取精子总DNA。DNA浓度用紫外分光光度计测定。

　　三、MTCYB基因引物的设计与合成

　　参照mtDNA的序列〔2〕，设计MTCYB基因引物为：5’-GGGACAGACCTAGTTCAATG-3’和5’-CTGCGGCTAGGAGTCAATAA-3’。同时设计MTATP6基因引物为：5’-CACCAACCACCCAACTATCT-3’和5’-TAAGGCGACAGCGATTTCT-3’。MTATP6基因的扩增作为检测模板是否可靠的对照(引物由上海生工公司合成)。MTCYB期待产物为523bp，MTATP6的期待产物为346bp。

　　四、PCR检测

　　每份标本均进行MTCYB及MTATP6的检测，PCR反应体积50μl，含DNA模板0.4μg，预变性后，94℃1min，60℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，延伸72℃ 7min，取10μl PCR产物，与1.5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并照相。

　　五、测序分析

　　MTCYB和MTATP6PCR产物经纯化后分别进行DNA序列测定(由大连宝生物公司进行)。

　　结　　果

　　一、PCR分析

　　MTCYB基因扩增产物、MTATP6基因扩增产物与期待扩增产物片段大小一致(图1)。
　　MTCYB基因缺失率在男性不育组为16％，其中精子活动率＜35％组检出9例，精子活动率＞70%组中检出7例，经统计学检验，二组差异无显著性(P＞0.05)。生育组30例标本中未检出MTCYB基因缺失。生育组与不育二组分别比较，差异均有显著性(P＜0.05)。不育组与生育组比较，差异有非常显著性(P＜0.01)。

　　二、DNA序列分析

　　为了证明PCR产物的正确性，PCR产物经纯化后进行DNA测序，结果证实PCR产物确为MTCYB和MTATP6基因片段。

　　讨　　论

　　精子活动能力是衡量精液质量和男性生育力的一项重要指标。近年来，mtDNA缺陷与精子活动力及男性不育之间是否相关引起关注。Kao等〔3〕研究发现mtDNA4977bp的缺失与精子活力呈负相关。本研究中，不育组精子活动率＜35％的标本中，检出9例MTCYB基因缺失，精子活动率＞70％的标本中，检出7例MTCYB基因缺失，二组比较无统计学差异，因此认为，MTCYB基因缺失与获能前的精子运动力差无直接关系。研究证明，获能前的精子主要依赖酵解供能，酵解供能过程不需线粒体参与〔4〕。精液常规检查的是获能前的精子运动状态，此时的活动能力主要反映的不是线粒体的功能，因此，此项检查并没能揭示不育患者精子活动能力差的原因。但生育组与不育组比较，差异有非常显著性，表明线粒体功能在生育过程中的重要作用。精子进入女性生殖道以后，开始获能，女性生殖道液中富含葡萄糖、丙酮酸盐与乳酸盐，为精子获能提供了能源物质，此时在精子线粒体中经氧化磷酸化产生大量ATP，使原来由酵解供能的精子代谢活性明显升高，出现一种特异的“鞭打样”(whiplashmotility)运动方式，通过此种运动方式，精子穿过卵子透明带而受精。在线粒体内膜中，呼吸复合体Ⅲ是线粒体氧化磷酸化电子传递中的第二个酶，它的缺失将不能催化电子从还原型辅酶Q到细胞色素C的转运，并把质子从线粒体内膜转移至膜外，而MTCYB是呼吸复合体Ⅲ中唯一由mtDNA编码的亚基，为高度保守的疏水蛋白，含有8或9个跨膜区和2个血红素基团，MTCYB与核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同构成呼吸复合体Ⅲ的中心成分。因此，MTCYB基因的缺失将直接影响线粒体氧化磷酸化过程，从而影响精子获能受精过程〔5〕。本研究结果表明，MTCYB基因的缺失可能是男性不育的原因之一。

　参考文献

　　1，赵权,方刚,王咏梅.快速、可靠的血和组织中DNA提取法.金陵医院学报1994，1∶48-49.

　　2，Anderson S,Bankier AT,Barrell MT,et al.Sepunce and organization of the hum an mitochondrial genome.Nature,1981,290∶457-465.

　　3，Kao SH,Chao HT,Wei YH.Mitochondrial deoxyribonucleic acid 4977 bp deletion is associated with diminished fetility and motility of human sperm.Biol Reprod1995,52∶729-736.

　　4，谢文英,王飞,江渔.男性学.第1版.上海：上海科学技术出版社.1991,138-139.

　　5，McKusick VA著.人类孟德尔遗传.罗会元等译.第11版.北京：北京医科大学中国协和 医科大学联合出版社.1998,3002-3003.