猪人异种移植超急性排斥反应补体激活途径的探讨

　　第二届全国基础免疫学学术战略研讨会于1999年12月10日至13日在广东从化温泉宾馆顺利召开。本次会议是在中国免疫学会的大力支持和第一军医大学的热情协助下，由基础免疫学分会委托第一军医大学分子免疫学研究所王小宁教授负责承办，会议的主要议题：1.基础免疫学研究进展和创新战略；2.基础免疫学科发展与科技产业化。根据1998年上海首届会议形成的惯例，参加会议的共40余名代表主要是国内基础免疫学领域具有一定学术地位和知名度的中青年专家学者，白求恩医科大学杨贵贞教授、暨南大学林剑教授等免疫学界老前辈欣然赴会，香港中文大学的廖永强教授和美国细胞治疗研究会的罗盖人教授作为特邀代表到会并发言，《中华微生物学和免疫学杂志》、《中国免疫学杂志》以及广州、深圳、珠海等地区的一些生物技术企业的专家学者也参加了本次会议。

　　本次研讨会由基础免疫学分会主任委员北京医科大学免疫学系的马大龙教授主持，第一军医大学热带军队卫生学系陈立明主任和李明副主任到会祝贺。北京医科大学免疫学系高晓明教授对“1999年国内外免疫学活动”进行了介绍，第四军医大学药立波教授对“细胞信号转导机理研究的现状与趋势”；暨南大学曾耀英教授对“T细胞活化和凋亡的方法学研究进展”；北京医科大学马大龙教授对“新细胞因子基因筛选克隆新战略”；第一军医大学陈正良副教授对“天然免疫学研究进展”；第一军医大学富宁教授对“Toll-like受体研究现状”等专题进行了精彩发言。廖永强教授针对“免疫与抗癌”及中药新药筛选问题进行发言；罗盖人教授结合“肌母细胞在基因治疗中的研究进展”对美国FDA等政府机构在应用基础研究领域中的导向性作用进行了系统介绍。军需大学的金宁一教授和第四军医大学杨安钢教授结合各自工作，对“HIV基因组结构与艾滋病疫苗研究现状”以及“基因治疗新策略的研究”等进行专题报告。并对“免疫学创新战略及其在生物高技术领域发展中的地位”、“免疫学开发项目的国内外趋势”、“建立免疫学技术平台对学科及产业的促进作用”等问题展开了热烈积极的研讨，并对合作建立免疫学功能服务实验室的计划提出许多积极和宝贵的建议。杜轶和徐杰两位编辑部主任就免疫学专业学术刊物的办刊情况向代表进行了介绍并广泛征求了大家的意见。会议还决定委托马大龙教授组织建立基础免疫学分会的互联通讯网，充分利用因特网资源，通过E-mail进行网上讨论、交流和业务求助等，希望求得大家的热情支持，并将有关资料发至masong@mail.bimu.edu.cn,以便尽快建立基础免疫学专家数据库。

　　异种移植最大障碍是由体液免疫造成的超急性排斥反应（Hyperacute rejection，HAR）。本实验用猪胸主动脉血管内皮细胞和人血清建立HAR体外模型，LDH释放法检测补体依赖的细胞毒作用，探讨HAR中补体激活途径。

　　1　材料与方法

　　1.1　猪血管内皮细胞的培养　手术取一段猪胸主动脉，使用胶原酶消化并制备内皮细胞悬液，接种于96孔平板中培养。

　　1.2　HAR模型的建立　在长满猪血管内皮细胞的96孔平板内，加入各种人血清。

　　1.3　LDH释放法检测补体依赖的细胞毒性反应　根据加入血清的不同，将实验分6组，即正常人血清组（HS）、灭活人血清组(HIHS)、IgM缺乏人血清组(IgM-D)、因子B缺乏人血清组(fB-D)、C1q缺乏人血清组(C1q-D)、猪血清组(PS)。在不同时间点取上清液200 μl用全自动生化仪读出LDH值，并换算出内皮细胞溶解率。

　　2　结果

　　HS组、fB-D组的内皮细胞溶解率明显高于PS组，而HIHS、IgM-D、C1q-D组的溶解率与PS组无显著差异；随着反应时间的延长，各组溶解率均有不同程度的升高，但在反应3～4 h后，均不再继续升高。另外，使用不同浓度血清与内皮细胞反应4 h，随着浓度的升高，PS组的溶解率无明显变化，而HS、fB-D组的溶解率逐渐增加（P＜0.01）。

　　3　讨论

　　猪人异种器官移植最棘手的问题是HAR。资料表明克服非协调性异种移植HAR的关键在于阻断补体激活［见：Mckenzie I　F　C, Osman N, Cohney S et al. Strategies to overcome hyperacute rejection of pig-to-human xenografts. Transpl Proc, 1997； 29: 973.Dalmasso A P, Vercellotti G M, Platt J L et al. Inhibition of complement-mediated endothelial cell cytotoxicity by decay-accelerating factor. Transpl,1991； 52: 530］。我们选择缺乏IgM、C1q的血清阻断补体激活的经典途径，缺乏因子B的血清阻断补体激活的替代途径，用灭活人血清阻断2种途径。结果发现，通过灭活所有补体或清除C1q、IgM，可使内皮细胞溶解率大大低于灭活或清除前，提示这种处理方法可减弱或终止人血清对猪血管内皮细胞的细胞毒性；而清除B因子后，细胞溶解率仍维持高水平,不能减轻细胞毒作用。可见，补体在HAR中是必要的，而且在猪人异种移植中，补体激活主要通过经典途径而不是替代途径，补体并不直接损伤内皮细胞，需要天然抗体参加。

　　另外，在反应达3或4 h时，细胞溶解率在各组内不再继续升高，提示细胞毒性在3～4 h接近高峰，HAR已经很严重。

　　而正常人血清与内皮细胞反应4 h 时，随着血清浓度的升高,细胞溶解率逐渐增加（P＜0.01），当升至25%和50%时，毒性差别不大（P＞0.05），提示人补体的浓度越高，对猪血管内皮细胞的细胞毒性越大，若彻底或尽可能(至少75%)清除人血清中的补体，可有助于控制HAR。

　　由于在猪人异种移植HAR中，经经典途径激活补体是主要的方式，那么若要阻断补体激活，仅仅阻断C3是不够的，必须阻断C3水平之前的补体成分。