维甲酸诱导基因RA538诱导人胃癌细胞系凋亡及其分子机制的研究

　　【 摘要 】　目的　研究全反式维甲酸（retinoic acid，RA）RA538诱导胃癌细胞的凋亡作用及其分子机制。方法　采用MTT、DNA梯度降解试验、原位末端标记、RT-PCR、Western blot等方法，对RA538重组腺病毒(Ad)在人胃癌细胞系中生物学作用及其分子机制进行体内外研究。结果　Ad-RA538对SGC7901细胞能产生明显的生长抑制效应，诱导SGC7901细胞凋亡。Ad-RA538生长抑制率为76.3%。Ad-RA538对SGC7901细胞产生的抑瘤效应及诱导凋亡作用是c-myc、bcl-2、bax、cyclin d1等一系列基因表达变化及其相互作用的结果，其中对c-myc及bax表达的调节作用是在RNA和蛋白水平。而对p53、p16、TGase、ras基因的表达没有明显影响。经Ad-RA538处理的SGC7901细胞致瘤性消失。Ad-RA538对裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射能有效降低肿瘤的生长速度，生长抑制率为60.7%。结论　Ad-RA538对胃癌细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用。其作用可能与抑制c-myc、bcl-2、cyclin d1基因及刺激bax基因表达的机制相关。与p53、p16、TGase及ras基因的表达无明显关系。

Studies on the apoptosis process and molecular mechanism of recombinant RA538 adenovirus on a human gastric cancer cell line——SGC7901

CHEN Jieping, lIN Chen, XU Caipu, et al.

　　(Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical university, Chongqing 400038, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　Studies on the apoptosis effects and molecular mechanism of recombinant RA538 adenovirus on human gastric cancer cell line in vitro and in vivo.Methods　Human gastric cancer cell line was treated respectively with Ad-RA538 and Ad-LacZ. MTT, dNA ladder, TUNEL, FCM, RT-PCR and Western blot were used.Results　Ad-RA538 could strongly inhibit cell growth and induce apoptosis of SGC7901 cells. The growth rate of the Ad-RA538-infected SGC7901 cells was inhibited by 76.3%. A series of expressions of c-myc, bel-2, bax and cyclin D1 and their interactions of each other resulted in SGC7901 cells growth inhibition and apoptosis, which were induced by RA538. Regulations for the expressions of c-myc and bax were at levels of RNA and protein, and there were no significant effects on expressions of p53, p16 TGase and ras. Treated with RA538, SGC7901 cells lost tumorigenicity. experimental therapy on the nude mice bearing subcutaneously transplanted tumor of SGC7901 cells showed that intratumor injections of Ad-RA538 inhibited the growth of the tumors. Ad-RA538-treated tumors were inhibited by 60.66%, compared with that of the tumor injected with Ad-LacZ and mock.Conclusion　Ad-RA538 can inhibit growth and induce apoptosis of gastric cancer cells in vitro and in vivo. RA538 makes effects on the expressions of c-myc, bcl-2, cyclin D1 and bax genes and leads to gastric cancer cells apoptosis finally.

　　【 Subject words 】　Adenovirus; gene therapy; Stomach neoplasms; Retinoic acid; Apoptosis

　　RA538为维甲酸(retinoic acid, RA)诱导基因〔1〕。其确切作用及机制尚不清楚，部分研究结果表明，该基因有明显抑制恶性表型的作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡及下调c-myc基因表达〔2〕。细胞凋亡是一个多基因参与的复杂过程，RA538基因对细胞凋亡相关基因表达的影响尚不清楚。本课题以胃癌细胞系作为靶细胞，研究腺病毒(adenovirus, ad)介导RA538诱导胃癌细胞凋亡作用及其分子机制，探索腺病毒介导RA538治疗胃癌的可行性，为胃癌的基因治疗提供候选基因，并为胃癌基因治疗的临床前研究提供实验依据。

　　材料与方法

　　细胞系及细胞培养：SGC7901细胞，为人胃腺癌细胞系（本室冻存）。用含10%胎牛血清的M199培养液培养。293细胞为腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系（由詹启敏教授惠赠），用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养。

　　重组体腺病毒制备：RA538及LacZ重组体腺病毒(Ad-RA538及Ad-LacZ)由中国医学科学院肿瘤研究所细胞生物室构建，为E1和E3区缺失的复制缺陷型腺病毒载体构建而成。采用Ad-RA538、Ad-LacZ经鉴定为阳性的重组体腺病毒，在293细胞中繁殖。将腺病毒以10×倍比稀释后，以293细胞进行滴度测定。提取病毒DNA，用一对RA538基因引物及一对腺病毒基因组引物进行PCR鉴定。

　　细胞生长曲线（MTT法）：采用96孔板，每孔接种细胞5?000～8?000个，24?h内按不同感染强度（multiplicity of infection, MOI）感染腺病毒。于不同时间点每孔加入MTT溶液（0.5mg/ml），4?h后弃去，另加入DMSO，振摇数分钟后酶标仪检测每孔吸光度（A）值。

　　细胞DNA梯度降解的检测：收集细胞，加裂解液400μl，离心取上清，加SDS至终浓度1%及RNA酶56℃作用2?h，乙醇沉淀DNA，干燥后溶于TE中，以琼脂糖凝胶电泳观察。

　　细胞凋亡原位检测（TUNEL试验）：按试剂盒方法进行。

　　流式细胞仪(FCM)分析：采用PI染色法。

　　逆转录PCR（RT-PCR）分析

　　细胞总RNA提取：按Promega公司的RNA gentsTM total RNA isolation system试剂盒说明分别提取并纯化细胞系的总RNA。

　　逆转录：采用Promega公司M-MLV逆转录试剂盒说明将细胞总RNA的mRNA逆转录成cDNA。

　　PCR条件：25μl体系中cDNA 2μl，10×PCR buffer，15mol/L MgCl2，4种dNTPs各25μmol/L，每次加两对引物（目的基因及β-actin）各50pmol/L，Taq酶1U，反应在PCR仪中进行。95℃5?min，95℃ 1?min，56℃ 1?min，72℃ 1?min，28～30个循环。

　　PCR引物序列：β-actin上游 5′GCGGGAAATCGTGCGTGACATT 3′，下游5′GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG 3′。RA538上游 5′ATGGGTGAACAACAGAAGAG 3′，下游5′TTAGAGATTCAGATTTGGCT 3′。c-myc上游 5′CTCTCAACGACAGCAGCCCG 3′，下游5′AGGTGATCCAGACTCTGACC 3′。bax上游 5′GCGTCCACCCAAGAAGCTGAG 3′，下游5′ACCACCCTGGTCTTGGATCC 3′。bcl-2上游 5′TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG 3′，下游5′TCACTTGTGGCTCAGATAGG 3′。p53上游 5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA 3′，下游5′CTTAGCACCTGAAGGGTGAAATATTC 3′。p16上游 5′CATGATGATGGGCAGCGCC 3′，下游5′CAGGGTTTCTCAGAGCCT 3′。TGase上游 5′TGACTGAGGAGCAGAAGACG 3′，下游5′CTCGAAGTTCACCACCAGCT 3′。C-Ki-ras上游 5′ACGTGGCGGTAGTTGGAGGC 3′，下游5′CCTCTATTGTTGGATCATAT 3′。

　　Western blot分析：RIPA裂解液裂解细胞,提取总蛋白。制备12% sDS-聚丙烯酰胺凝胶。采用Bio-Rad公司的垂直电泳装置进行电泳。按Bio-Rad公司转膜装置将蛋白样本转移至硝酸纤维膜上。电泳及转膜条件见产品说明书。杂交按Amershan公司的ECL western blotting kit 说明进行。将膜置暗盒中X光片曝光。

　　裸鼠致瘤性及皮下移植瘤模型治疗实验

　　裸鼠致瘤性：接种SGC7901细胞于60mm培养皿中，按MOI 100加入Ad-RA538或Ad-LacZ腺病毒，24?h内消化细胞，制成细胞悬液，106/只接种于裸鼠右上肢背侧皮下。每组为3只5周龄鼠。连续观察肿瘤出现时间及体积，时间为1个月。

　　裸鼠皮下移植瘤模型：收集SGC7901细胞，制成107 cell/ml细胞悬液，按100μl/只量接种于裸鼠皮下（5周龄鼠），待肿瘤长至5mm左右时，随机分组，每组5只，肿瘤内注射Ad-RA538或Ad-LacZ病毒液（109单位病毒）或PBS0.1ml，隔日注射1次，共3次，连续观察肿瘤大小。

　　统计学分析：采用χ2检验及t检验。

　　结果

　　1.重组体腺病毒的制备：各种重组体腺病毒，经293细胞繁殖后制备成病毒贮存液，贮存于-70℃冰箱。重组体腺病毒滴度测定Ad-RA538、Ad-LacZ分别为：3.3×1010、3.3×1011 PFU/ml。重组体腺病毒PCR鉴定：Ad-RA538显示腺病毒及RA538阳性扩增条带，Ad-LacZ显示腺病毒阳性扩增条带。

　　2.Ad-RA538对SGC7901细胞形态学影响及生长的抑制作用：以Ad-RA538 mOI 100感染SGC7901细胞，均于1～3?d开始出现细胞扩增聚集，变圆，胞浆中有空泡，4～5?d后细胞浮起。Ad-LacZ以MOI100感染时，细胞不出现明显的形态学变化。用MTT法显示Ad-RA538对SGC7901细胞生长抑制率为76.3%（MOI 200，8?d）。与Ad-LacZ组比P＜0.01。见图1。

　　3.Ad-RA538对SGC7901细胞的凋亡诱导作用：Ad-RA538可诱导SGC7901细胞凋亡。DNA梯度降解试验显示Ad-RA538作用2、4、6?d后均出现明显的DNA ladder现象(图2)。细胞凋亡原位检测法显示Ad-RA538处理的SGC7901出现明显凋亡(图3)。FCM分析SGC7901细胞经Ad-RA538及Ad-LacZ作用后G1期、G2 m期、S期百分比：12?h分别为74.6%、13%、12.4%及66.5%、15.3%、18.2%，4?d分别为39.7%、26.6%、33.8%及71.0%、12.4%、16.6%，6?d分别为44.4%，20.9%，34.7%及73.3%、8.4%、18.3%。显示RA538组12?h g1期阻滞，4?d、6?d S期及G2 M期阻滞。2?d开始出现凋亡高峰，2、4、6?d的凋亡峰分别为34.2%、18.2%、22%。