一氧化氮对肿瘤坏死因子诱导血管内皮细胞与白细胞粘附的实验研究

　　肿瘤坏死因子(TNF)诱导的血管内皮细胞与白细胞的粘附以及一氧化氮(NO)对此粘附过程的影响，报告如下。

　　材料与方法

　　材料　(1)白细胞提取：用Ficoll分离液获取人外周血白细胞，培养基DMEM(含10%FCS)悬浮配成浓度为105个/ml；(2)血管内皮细胞培养：24孔培养板(每孔104个细胞悬液)培养人脐静脉内皮细胞ECV-304。待细胞生长至对数增长期，分组实验；(3)ECV-304人脐静脉内皮细胞(武汉大学动植物保藏中心提供)。鼠抗人ICAM-1单克隆抗体以及SABC-FITC试剂盒购于北京中山公司。SNAP、TNF系sigma公司产品。

　　方法　实验分组：分5组以观察内皮细胞受刺激后粘附的白细胞数。C组为对照组，不加任何刺激剂。T组每孔加入TNF的刺激浓度为100U/ml。TN组为TNF和NO组，在加入TNF之前，加入新鲜配制的S-亚硝基-N-乙酰青酶胺(SNAP)500μm，以观察NO对TNF诱导粘附的影响。N组只加入新鲜配制的SNAP500μm。待各组刺激达12小时后，每孔加入105个白细胞于37℃共同孵育20分钟。倒置相差显微镜下计数每高倍视野(400×)中粘附到内皮细胞上的白细胞数，并计算占该视野中内皮细胞数的百分数。TA组方法同T组，TNF刺激内皮细胞达12小时后，每孔加入抗粘附分子ICAM-1单抗，与37℃孵育30分后，每孔加入105个白细胞于37℃共同孵育20分钟。以观察抗ICAM-1抗体对TNF诱导粘附的影响。除TA组外其余各组待刺激剂刺激内皮细胞12小时后，每孔取少许细胞104个，离心机固定于载玻片上按常规免疫细胞化学方法来观察内皮细胞膜ICAM-1的表达。

　　统计学分析　所有指标均以均数±标准差表示。粘附到内皮细胞上的白细胞数变化采用χ2检验，ICAM-1表达采用t检验分析。P＜0.05为显著性差异。

　　结　果

　　内皮细胞粘附白细胞数的变化　刺激12小时后C组粘附的白细胞数占整个视野内皮细胞数的百分数为15.79%。T组受TNF刺激，粘附的白细胞数增加为67.47%，同C组比有极显著性差异。N组SNAP刺激内皮细胞粘附的白细胞数16.23%，同C组比无显著性差异。TN组同TA组粘附的白细胞数分别为52.36%和50.51%，同T组比仍具有显著性差异。说明NO和抗ICAM-1单抗阻滞了TNF诱导的粘附。

　　内皮细胞膜ICAM-1表达　计算机图象分析内皮细胞膜ICAM-1表达的积分光度，可见T组较C组比明显降低(P＜0.01)。虽TN组同C组比，P＜0.01，但同T组比仍具有显著性差异，说明SNAP抑制 TNF诱导的ICAM-1表达。N组同C组比无显著性差异。

　　讨　论

　　本实验观察到，受TNF刺激12小时，不仅大量PMN粘附到内皮细胞层上，而且内皮细胞膜表达ICAM-1增高。抗ICAM-1单抗和TNF共同刺激则粘附的PMN明显减少，说明ICAM-1介导了TNF诱导的内皮细胞与白细胞之间的粘附。N组SNAP500μm刺激内皮细胞表达ICAM-1以及内皮细胞与白细胞粘附同C组比无显著性差异。说明SNAP本身不影响ICAM-1的表达。TN组内皮细胞膜ICAM-1表达以及粘附的白细胞数同T组比明显减少，说明SUAP即NO可降低TNF诱导的内皮细胞ICAM-1的表达，从而降低炎性细胞与内皮细胞粘附。