人体嗜铬细胞培养的实验研究

www.cnkang.com 2007-3-24 13:38:00 中华康网

　　【摘要】　目的　观察连续5天体外培养人体肾上腺嗜铬细胞的生长情况和儿茶酚胺分泌功能的变化，以便选择细胞移植的适宜时机。方法　取6例健康成人脑死亡的双侧肾上腺，按李氏改良方法，培养5天。每24小时记录培养细胞生长情况，更换培养液，并采用高效液相色谱技术检测培养液中儿茶酚胺含量。培养第3天的细胞，采用免疫细胞化学(SABC)技术检测酪氨酸羟化酶表达阳性细胞，并计数阳性细胞百分率。结果　(1)培养第3天的人体嗜铬细胞形态结构完整，生长良好；(2)免疫组化检测显示酪氨酸羟化酶表达阳性细胞为72%，细胞内嗜铬颗粒清晰；(3)培养液去甲肾上腺素和肾上腺素含量，在培养第3天均较第1天明显升高(P＜0.01)。多巴胺含量在第2、3天均有升高(P＜0.05)。结论　本组人体嗜铬细胞体外培养第3天是进行细胞移植的适宜时机。

Experimental study of culture of human chromaffin cell

FU Zhijian，BI haosheng，SONG wenge，et al.

　　department of Anesthesiology，Tongji hospital of Tongji Medical University，Wuhan430030

　　【Abstract】Objective The growth condition of human chromaffin cells primary cultured in vitro for 5 days was observed successively in order to find the proper time to transplant.Methods bilateral adrenal glands of 6 healthy adults with dead cerebrum were taken out respectively.According to the modified Lis method，the chromaffin cells were cultured in vitro for 5 days.During culture，the growth of the cells was observed microscopically and the culture solution was replaced every 24 hours.The supernatant was assessed with high-performance liquid chromatography for determination of catecholamine production.The cells cultured on the 3rd day were assessed immunocytochemically by labeling the cells with tyrosine hydroxylase antibody and the percentage of positive cells was counted.Results (1)The growth of human chromaffin cells cultured on the 3rd day was better；(2) immunocytochemical results showed that positive cells expressed with tyrosine hydroxylase were 72%. The granules in the cells were clear；(3) the levels of noradrenaline and adrenaline cultured on the 3rd day were significantly increased comparing with that on the 1st day and 5th day (P＜0.01).The amount of dopamine was increased on both 2nd and 3rd day (P＜0.05).ConclusionsThe 3rd day of human chromaffin cells primamry cultured in vitro is the proper time to transplant.

　　【Key words】 Chromaffin cell Culture in vitro

　　蛛网膜下腔移植嗜铬细胞致中枢性镇痛作用，已成为生物性镇痛方法的一个研究热点。然而国内外有关的研究仍主要集中在动物实验阶段［1～5］，成功地培养有分泌功能的人体嗜铬细胞是进行临床研究的先决条件。本实验旨在摸索人体嗜铬细胞的培养过程，观察培养细胞的生长情况和分泌功能变化，为临床选择细胞植入的时机提供依据。

　　资料与方法

　　细胞培养　取6例健康成人脑死亡的双侧肾上腺，按李金元等［6］改良方法进行人体嗜铬细胞的原代培养，共5天。将肾上腺快速置入4℃Hanks液中，并反复冲洗，钝性分离肾上腺皮质和髓质，并将分离的髓质组织移至另一平皿中，尽量剪碎，全部收集到试管中，整个分离过程均在冰浴中进行。向试管中加入0.25%胰蛋白酶溶液2～3ml，置入37℃水浴箱中消化。30分钟后取出试管，反复吹打，然后加入RPMI-1640培养液2ml终止消化。经300目不锈钢网过滤，收集全部滤液至试管中。离心(1　000r/min)10分钟，弃去上清液，加入RPMI-1640培养液3～5ml，取样进行细胞计数，调整细胞浓度至105/ml，置37℃、5%CO2培养箱中培养5天。

　　细胞鉴定　(1)形态学鉴定：每隔24小时于双相倒置显微镜下观察并记录培养细胞的生长情况，连续观察5天；(2)免疫细胞化学检测：在细胞培养的第3天，收集细胞培养液，离心(1　000r/min)5分钟，弃去上清液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，制成细胞滴片。自然干躁后，用4%多聚甲醛溶液固定，采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶(SABC)法进行免疫组化检测。滴加小鼠抗人酪氨酸羟化酶单克隆抗体(1∶100)4℃过夜。PBS冲洗后，加生物素标记的羊抗小鼠抗体(1∶100)37℃30分钟。PBS冲洗，再加新鲜配制的过氧化物酶标记的亲合素30分钟。PBS冲洗，3，3-二氨基苯联胺(DAB)；避光显色5分钟。自来水冲洗后，常规脱水透明封片。光镜下观察酪氨酸羟化酶表达阳性细胞，并计数阳性细胞百分率；(3)高效液相色谱检测：每24小时观察培养细胞的生长情况后，更换培养液。更换的残液离心后，收集上清液3ml，置于－80℃冰箱中冻存，集中检测。色谱条件是流动相甲醇∶双蒸水(60∶40)，流速1ml/min。检测波长为EX345nm、EM485nm。

　　统计学分析　计数资料以百分率表示，计量资料采用t检验，P＜0.05为有显著性差异。

　　结　果

　　细胞生长情况　见图1～3。图1为培养第1天，细胞胞体略显肿胀，体积较大，胞浆透明，胞核尚清晰；图2为培养第3天，细胞结构完整，边界规则，胞浆饱满，核清晰，示细胞生长良好；图3为培养第5天，可见细胞变形破损，细胞核模糊，折光差。