胰岛素分泌与糖尿病：从分子到临床

　　Graves'病(GD)为一常见病，属于自身免疫性疾病，患者血清中存在着抗促甲状腺激素(TSH)受体的自身抗体(TRAb)，它可刺激甲状腺细胞分泌过多的甲状腺激素，致甲状腺机能亢进，但此病的发病机制仍未十分明确。原癌基因在细胞的生长、分化和发育方面起着重要的作用。c-fos是一类核内原癌基因，它可被激素快速而短暂地激活，它也是转录激活因子AP-1的组成成份，它的激活是基因表达中最早的变化之一，这表明c-fos在信号传导中起着关键的作用。因此甲状腺细胞生长与c-fos mRNA表达的内在联系就成为一个新的研究方向。

　　本文就TRAb诱导大鼠甲状腺(FRTL-5)细胞原癌基因c-fos表达与Graves’病甲状腺肿机制进行了研究及探讨。

　　一、材料与方法

　　1.血清IgG的提取：11例经临床确诊甲状腺Ⅱ度肿大的GD患者(其中8例未经治疗)和15例正常对照者血清经Protein A Sepharose CL-4B亲合层析法提纯IgG，冷冻干燥成粉末。

　　2.FRTL-5细胞的培养：参照Hatabu等人的方法，使用含5%小牛血清，3H(1U/L bTSH,1　　mg/L牛胰岛素，5mg/L人转铁蛋白)，3抗(240U/ml青霉素，160U/ml庆大霉素，200mg/L链霉素)的F-12培养液(GIBCO)，在37℃，5%CO2细胞培养箱中培养FRTL-5细胞，每隔3～4天换液。

　　3.刺激cAMP分泌：FRTL-5细胞转移到24孔板培养7天至亚融合状态，换无bTSH的2H培养液继续培养6天，用TRAb刺激后，使用3H-cAMP试剂盒(中国原子能研究所)检测cAMP含量。

　　4.FRTL-5细胞生长的检测：使用3H-胸腺嘧啶核苷(3H-Tdr)掺入细胞DNA的方法。FRTL-5细胞转移到24孔板培养7天至亚融合状态，换无bTSH的2H培养液继续培养6天后，再换成含有终浓度为2　　g/L的F-12培养液0.5 ml，培养42小时。移出上清液，改换含有185　　kBq的3H-Tdr的PRMI-1640培养液0.25ml，培养5小时。移出1640培养液，用冷PBS(pH 7.4)洗两次，10%三氯醋酸洗两次。加2% SDS液0.5ml将细胞移入液闪瓶，进行每孔的cpm计数。

　　5.细胞总RNA的提取：待FRTL-5细胞生长到1.5×106/瓶时，改换无bTSH的F-12培养液(即2H培养液)5　　ml继续培养4天。将每瓶培养液各吸出3ml(余弃之)分别加入刺激物后再加到原培养瓶中置37℃温育，其中：(1)作为阴性对照的正常人hIgG 5g/L刺激半小时；(2)作为阳性对照的bTSH，使其终浓度分别达到1、5、10U/L刺激半小时及10U/L刺激1小时；(3)TRAb分别为2或5　　g/L刺激半小时。然后倾去刺激液，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取各瓶细胞总RNA，每瓶大约可获得30μg RNA。

　　6.1.3kb v-fos探针的制备和标记：用LB培养基培养带有pBR322质粒的E.coli菌。pBR322质粒经PvuⅡ和Bgl Ⅱ酶切后，行1%琼脂糖电泳，经低融点琼脂糖凝胶(Sigma)回收1.3kb片段。使用GIBCO公司的切口平移试剂盒(Nick Translation System)，按其说明书操作，将1μg v-fos DNA探针用1850kBq〔α-32P〕dCTP标记后，乙醇沉淀，溶于0.1ml TE溶液中。

　　7.Northern杂交和放射自显影：每份总RNA样品各取20μg，行甲醛变性胶电泳(3-4V/cm)约2.5小时后EB染色，以检测RNA的质量。随后凝胶用经DEPC处理过的超纯水淋洗数次，以去除甲醛。然后经毛细作用将RNA转移至硝酸纤维素膜上，晾干后，80℃干燥2小时，在不含甲酰胺的预杂交液中68℃预杂交2小时，再转入杂交液中，加入1μg经100℃，5分钟变性的v-fos标记探针，68℃杂交24小时。硝酸纤维素膜经漂洗后，夹在保鲜膜中，放入带有增感屏的暗盒-70℃放射自显影成像。

　　二、结果

　　1.TRAb刺激细胞外cAMP的积累：TRAb刺激FRTL-5细胞后，在正常对照组，TSH阳性对照组及TRAb组中cAMP的数值分别为0.92±0.51，2.10±1.87及1.77±1.15，经T检验分析，TSH组和TRAb组中cAMP水平均明显高于正常对照组(P＜0.05)，表明TRAb的作用类似于TSH。

　　2.TRAb刺激FRTL-5细胞生长：TRAb刺激FRTL-5细胞后，TRAb组及正常对照组的3H-Tdr掺入量(cpm值)分别为137.7±46.2及100.9±38.5，经T检验分析，TRAb组的3H-Tdr掺入量明显高于正常对照组(P＜0.05)，表现为促进甲状腺细胞生长。

　　3.TRAb刺激c-fos mRNA的表达的放射自显影结果：当TSH均为10U/L，30分钟的刺激效果明显优于1小时的刺激效果。随着TSH刺激剂量的增加(1、5、10U/L),c-fos mRNA的表达量也随之增加。

　　正常对照存在微量的c-fos表达。在TRAb组中，除GD3和GD4患者与正常对照差别不明显外，其余标本的c-fos表达量均明显高于正常对照。GD4患者的TRAb处于正常范围。GD3患者的原因待查。

　　三、讨论

　　本研究以cAMP含量作为甲状腺细胞功能刺激的指标，以3H-Tdr掺入量作为甲状腺细胞生长刺激的指标，均表明它们在TRAb组的含量都明显高于正常对照组(P＜0.05)。本室已报导过类似的结论，即当TGI与TSH受体结合后，甲状腺细胞可能分泌过多的cAMP，从而引起功能亢进；TGI可引起甲状腺滤泡细胞的生长及TRAb可增加FRTL-5细胞内3H-Tdr掺入量的增多；TGI与甲状腺肿大小存在相关性的结果。这都提示TRAb在GD病发病中起着重要作用。

　　放射自显影X光片显示，TSH可诱导c-fos的表达，且表达量随刺激量的增加而增加。在相同刺激剂量时，刺激效果表明刺激30分钟优于刺激1小时。

　　经亲合层析法制备的正常人IgG中不含有TSH，并且正常人IgG诱导产生c-fos的表达水平是极低的。本实验采用的正常人IgG的剂量为5g/L所产生微量表达现象的原因可能主要与使用的刺激量较大有关，文献中也观察到类似的现象，尽管他使用的刺激量是1　　g/L。由于目前国外涉及此方面的报道不多，且本实验观察例数也不多，其原因有待探讨。

　　在TRAb组中，除GD3患者和GD4患者与正常对照差别不明显外，其余标本的c-fos表达量均明显高于正常对照。GD4患者的TRAb处于正常范围，所以其c-fos的表达接近于正常对照。而GD3患者的原因待查，考虑到TRAb阳性率为71.5%，故对此现象需进行深入的研究。

　　近来的研究表明，在正常的真核细胞基因中存在着某些与病毒癌基因结构相似的碱基序列，经活化后能转变为有转化能力的癌基因。很多资料亦证明了v-fos的碱基结构与c-fos的同源特征。

　　fos基因的确切功能还不十分清楚，而FRTL-5细胞所必需的生长因子TSH能诱导c-fos的表达则进一步提示了c-fos在调控细胞分化过程中能起到一定的作用。由于c-fos的转录激活是基因表达中最早的变化，因此它可能在信号转导系统中起着关键的枢钮作用，从而可能会将受体占位的短期刺激与基因表达的长期效应(如刺激或生长)联系起来。本实验结果与文献的报导结果一致。此现象的产生可能是由于TSH和类似TSH作用的自身抗体TRAb作用于TSH受体，然后途经腺苷酸环化酶系统使细胞内的第二信使cAMP含量增高，并且cAMP的反应片段是位于c-fos起动因子之前的-60位处，从而可进一步诱导激活c-fos基因，合成FOS蛋白，它作为一个特异的核酸调节片段就承担了增强的转化后的修饰功能并参与蛋白质的合成，从而促使甲状腺细胞的生长。这就暗示了TRAb和原癌基因c-fos在Graves'病甲状腺肿的致病作用，从而为研究此病发病机制提供了一个新的且重要的线索和研究方向。

　　本研究表明来自Graves'病患者的TRAb可诱导FRTL-5细胞的增殖及c-fos的表达，这在某种程度上提示了TRAb可促使c-fos表达进而导致甲状腺细胞生长增殖，在临床上表现为甲状腺肿大。

　　*本课题为天津自然科学基金资助项目