胰岛素抵抗细胞模型的胰岛素降解酶表达

　　【摘要】　目的　 了解胰岛素降解酶(IDE)基因、酶蛋白表达水平与胰岛素敏感性的关系，并初步探讨胰岛素 降解抑制剂氯喹改善胰岛素敏感性的分子机制。方法 　以原代大鼠肝细胞胰岛素抵抗(IR)模型为研究对象，分别采用免疫印迹技术和逆转录-聚 合酶链反应(RT-PCR)技术检测IR细胞模型的IDE酶蛋白表达(EIP)及基因表达水平(EIG)，同 时检测IDE　活性和反映细胞胰岛素敏感　性的14C-2-脱氧葡萄糖掺 入率及14C-醋酸盐掺入率，并观察氯喹对IR细胞模型上述指标的影响。结果IR细胞模型的EIG及EIP水平显著高于对照细胞，并与其IDE活 性呈显著正相关 ，与两种掺入率呈显著负相关。同时氯喹可明显抑制IR细胞模型以及对照 细胞的EIG 及EIP水平，而且抑制的程度与氯喹作用时间的长短密切相关。结论　大鼠肝细胞的EIG和EIP与其胰岛素敏感性之间呈负相关关系；高浓度胰岛 素可刺激大鼠肝细胞的IDE基因mRNA及酶蛋白的表达，而氯喹则对其起明显的抑制作用；胰 岛素和氯喹对大鼠肝细胞EIG的影响可能是通过影响IDE基因转录来实现。

Expression of insulin-degrading enzyme in insulin- resistance cell model

LI Chenzhong　ZHANG Suhua　SHU Chan gda　et al

　　（Department of Endocrinology,The First Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400016）

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship among expression of insulin-degrading enzyme (IDE ) gene (EIG), enzyme protein and insulin sensitivity, and to investigate the mol ecular mechanism for improvement of insulin sensitivity by chloroquine. Methods　Expression of IDE protein (EIP) and EIG were de termi ned on insulin-resistance (IR) hepatocytes of rat by immunoblotting technique a nd RT-PCR respectively. Incorporation rate of 14　　C-2-d eoxyglucose and 14　　C-acetate which were used to estimate insulin sensitivity of cells, and IDE activity were determined in IR hepatocyte s of rat. Moreover, effects of chloroquine on these indices were observed. Results　EIG, EIP in IR cells were higher than those in the control cells. EIG and EIP were positively correlated with IDE activity, and negatively correlated with the two kinds of incorporation rate. Chloroquine significantly decreased EIG and EIP in IR cells and control cells, and the decr eases in EIG and EIP were correlated with the duration of treatment. Conclusion　EIG and EIP of rat hepatocytes were negatively c orrelated with insulin sensitivity; EIG and EIP of rat hepatocytes can be stimul ated with insulin at high concentration and inhibited with chloroquine; Effects of insulin and chloroquine on EIG may influence the transcription of EI P in the hepatocytes of rat.

　　【Key words】　Chloroquine; Insulysin; Gene expression ; Insulin resistance; Hepatocyt

　　胰岛素降解酶(IDE)活性升高致胰岛素降解过快与胰岛素抵抗(IR) 的发生有关，IDE抑制剂可改善胰岛素敏感性〔1，2〕。本研究以大鼠原代肝细胞IR 模型为研究对象，研究IDE基因表达与胰岛素敏感性的关系，并探讨IDE抑制剂氯喹改善IR的 机制。

　　材料和方法

　　一、原代大鼠肝细胞IR模型的建立

　　采用高浓度胰岛素诱导培养法复制Wistar大鼠原代肝细胞的IR模型〔3〕，本研究将 在含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中孵育16 h的细胞为IR细胞，在不含胰岛素的培 养 液中孵育16 h的细胞为对照细胞，未经16 h孵育的细胞为空白细胞。

　　二、原代大鼠肝细胞的IDE活性测定

　　采用放射酶分析法测定，按文献操作〔4〕。

　　三、原代大鼠肝细胞的胰岛素敏感性测定

　　采用14C-2-　脱氧葡萄糖　(14C-2-DG)　掺入率和14C-醋酸盐掺入率评 价大鼠肝细胞的胰岛素敏感性〔5，6〕。14C-2-DG和14C-醋酸盐均 购自Sigma。

　　四、原代大鼠肝细胞胰岛素降解酶基因(EIG)的表达

　　采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)〔7〕检测EIG水平。原代大鼠肝细胞经16 h培 养后，于室温向培养板中加入Tripure试剂(Boeheringer Mann-heim产品)使细胞裂解后， 按说明书提取细胞总RNA。IDE基因引物根据大鼠IDE基因的cDNA序列〔8〕设计，扩 增 片 段300 bp，引物序列为：上游引物P1 5'-AATGATACTCTCTGCAGA-3'，下游引物P2 5'-GT TTGAATCACCTGAGTC-3'。内标准物为β-actin，采用文献的引物序列，扩增片段270 bp ，其序列为：上游引物P3 5'-AAATCGTCGGTGACATCAAA-3'，下游引物P4 5'-ATCGTACTCGTG CTTGCTGA-3'。两对引物均由上海生工生物公司合成。cDNA第一链合成使用MBI Fermentas RT-PCR试剂盒。cDNA第一链合成结束后，用PCR扩增cDNA第一链，反应条件为：94℃ 5 min 后，进行40个循环扩增(94℃,1 min；55℃，45 s；72℃，90 s)。再经72℃ 10 min、4℃ 5 min后，即可进行扩增产物鉴定。凝胶用凝胶成像分析系统紫外光成像，并经专用图形分析 软件测出各条区带光密度值，结果以IDE区带的光密度值积分/β-actin区带的光密度值积 分表示。

　　五、大鼠肝细胞IDE酶蛋白(EIP)的表达

　　采用免疫印迹技术检测〔7〕。用Tripure试剂盒从细胞裂解物中提取RNA的同时提取 蛋白质。蛋白样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，剥离凝胶，150 V半干式电转移30～45 m in。电转移结束后，向NC膜上依次加入抗大鼠IDE多克隆抗体(1抗，工作浓度1:100，德国Sc hnide教授惠赠)和HRP标记的兔抗小鼠IgG(2抗，工作浓度1:1　　000，北京中 山生物技术公司 )孵育，DAB显色液显色。NC膜经凝胶成像分析系统可见光成像后，图像用图形分析软件测出 各条区带的光密度值。

　　六、氯喹对原代大鼠肝细胞的IR形成过程中EIG及EIP水平的影响

　　A1细胞：在加入1 mg/ml氯喹的含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中经16 h孵育的大鼠 肝细胞。A2细胞：在加入1 mg/ml氯喹的不含胰岛素的培养液中经16 h孵育的大鼠肝细胞。

　　孵育结束后，检测EIG和EIP水平。

　　七、氯喹对原代大鼠肝细胞的IR模型的EIG及EIP水平的影响

　　B1细胞：在含5×10-7 mol/L胰岛素的培养液中孵育16 h后，继续在含有1 mg/ml氯喹 但不含胰岛素的培养液中孵育2 h的原代大鼠肝细胞。B2细胞：在不含胰岛素的培养液中孵 育16 h后，继续在含有1 mg/ml氯喹但不含胰岛素的培养液中孵育2 h的原代大鼠肝细胞。

　　孵育结束后，检测EIG及EIP水平。

　　八、统计学处理

　　EIG、EIP均以光密度表示，IDE活性单位为U/mg蛋白。数据以±s 表示。两组间比较采用t检验，多组间分析采用方差分析和Newman-Keu ls检验，相关分析采用直线回归分析。

　　结　　果

　　一、大鼠原代肝细胞的EIG、EIP水平和IDE活性(表1)

　　培养后再加入氯喹培养2h的B1细胞，其EIG、EIP水平和IDE活性低于IR细胞，高于在无胰岛素的 培养液中孵育16h后再加入氯喹培养2h的B2细胞。同时，B1、B2细胞 的EIG、EIP水平和IDE活性分别高于A1、A2细胞，但与对照细胞无差异。

　　二、大鼠肝细胞EIG、EIP水平与IDE活性及胰岛素敏感性的关系(表2)

　　EIG、EIP水平在上述三组细胞均与IDE活性呈显著正相关。在IR细胞和对照细胞 ，EIG、EIP与14C-2-DG掺入率和14C-醋酸盐掺入率均呈显著负相关，但在 空白细胞上述指标间无相关性。此外，三组细胞的EIG均与EIP呈显著正相关。

　　讨　　论

　　本研究结果显示，IR细胞模型的EIP水平显著高于对照细胞，表明大鼠肝细胞出现IR后，其I DE酶蛋白翻译量明显增强；在IR细胞模型的IR状态形成过程中(A1细胞)或已经出现IR(B1细 胞)后加入氯喹培养，IR细胞的EIP水平在显著下降的同时，其胰岛素敏感性得到相应改善； 向对照 细胞中(A2细胞和B2细胞)加入氯喹培养后，细胞的EIP也显著下降。本组还显示，用氯喹处 理16h的A1、A2细胞的EIP水平分别低于氯喹处理2 h的B1、B2细胞。上述结果提示，氯喹 可以明显抑制IR细胞和对照细胞的EIP水平，而且抑制作用的强弱与其作用时间长短有关。

　　由于基因转录水平和翻译水平均可影响编码蛋白的表达量，因此在观察到酶蛋白表达量变化 后，有必要进一步了解酶基因mRNA转录水平的变化，以初步了解酶蛋白表达量增加的原因。 本组资料显示，IR细胞的IDE基因mRNA转录水平显著高于对照细胞，提示大鼠肝细胞出现IR 后，其EIP水平增加可 能是由于该酶基因转录水平增强所致。向细胞培养液中加入氯喹处理后，无论是IR细胞，还 是对照细胞，也无论氯喹处理时间的长短，大鼠肝细胞的EIG水平的变化与氯喹对IDE酶蛋白 表达量的影响基本一致，而且影响程度的大小也与氯喹作用时间的长短密切相关，这一结果 表明氯喹可以明显抑制IR细胞和对照细胞的EIG水平，并提示氯喹对IDE酶蛋白翻译的抑制作 用可能是通过作用于上游的IDE基因转录的某些环节来实现的。高浓度胰岛素刺激IDE基因转 录和氯喹抑制IDE基因转录的原因均有待于进一步研究。

　　为探讨大鼠肝细胞EIP、EIG水平与IDE活性及胰岛素敏感性的关系，本组资料还对上述指标 进行了相关分析。为排除氯喹的影响以及氯喹作用时间不同的可能影响，本组只选择了IR细 胞、对照细胞和空白细胞进行分析。结果显示，EIP及EIG水平在三组细胞均与IDE活性呈显 著正相关，提示IDE活性与IDE酶蛋白表达水平及基因转录水平有良好的一致性。本组同时显 示，IDE酶蛋白表达水平及基因转录水平在IR细胞和对照细胞均与反映细胞胰岛素敏感性的 两种掺入率呈显著负相关，提示当IDE基因表达亢进时，细胞的胰岛素敏感性将会下降，这 与胰岛素降解过快可能是IR的原因之一理论相符合〔9〕。

　　综上所述，本研究结果提示，大鼠肝细胞的EIG和EIP与其胰岛素敏感性之间呈负相关；高浓 度胰岛素可刺激大鼠肝细胞的IDE基因mRNA及酶蛋白的表达，而氯喹则对其起明显的抑制作 用；胰岛素和氯喹对大鼠肝细胞EIG的影响可能是通过对IDE基因转录水平的影响来实现的。

　　基金项目：四川省卫生厅基金资助项目( 920047)；重庆市科委应用基础研究基金(97-4-175)

参　考　文　献

　　1，Authier F, Ponsner BF, Bergeron JJ. Insulin- degrading enzyme. Clin Invest Med, 1996,19:149-160.

　　2，Powrie JK, Smith GD, Shojaee-Moradie F, et al. Mode of action of chl oroquine in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Physio l, 1991,260:E897-904.

　　3，李晨钟， 张素华， 舒昌达， 等. 胰岛素诱导的胰岛素抵抗细胞模型 的建立和鉴定. 重庆医科大学学报， 1998，23：335-337.

　　4，Ghem BD, Kuo WL, Perman BK, et al. Mutation in Zinc-binding domain of human insulin-degrading enzyme eliminate catalytic activity but not i nsulin binding. J Biol Chem, 1993,268:7943-7948.

　　5，Melin B, Cherqui G, Blivet MJ, et al. Dual effect of metformin in cult ured rat hepatocytes: potentiation of insulin action and prevention of insulin- induced insulin resistance. Metabolism, 1990,39:1089-1094.

　　6，Baumeister H, Bergerman BK. The rat insulin-degrading enzyme molecula r cloning and characterization of tissue specific transcripts. FEBS Lett, 1993,3 17:250-255.

　　7，J. 萨姆布鲁克， 等著. 金东雁， 黎孟枫， 等译. 分子克隆实验指 南. 第2版. 北京：科学出版社， 1996,683-888.

　　8，，Kuo WL, Gehm BD, Rosner MR, et al. Regulation of insulin degr adation: expression of an evolutionarily conserved insulin-degrading enzyme inc rease degradation by an intracellular pathway. Mol Endocrinol, 1991,5:1467-1476 .

　　9，Duckworth WC. Insulin degradation: products, mechanism and significanc e. Endocrinol Rev, 1989,9:319-345.