谷氨酸脱羧酶通过调节T细胞亚群预防NOD小鼠发生1型糖尿病

　　关键词： 谷氨酸脱羧酶；小鼠，近交NOD；糖尿病，胰 岛素依赖型；T淋巴细胞亚群

　　【摘要】　目的　 了解谷氨酸脱羧酶(GAD)对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的1型糖尿病是否具有预防作用并探讨其 免 疫作用机制。方法　用猪脑GAD和不完全弗氏佐剂(FIA )混合后给4周龄雌性NOD小鼠腹腔注射(32例)，同时单独注射等量FIA作为对照组。8周龄时 腹腔注射环磷酰胺以加速糖尿病。每周测定体重、血糖，糖尿病形成2周或20周龄处死小鼠 后测定血清C-肽、GAD抗体(GAD-Ab)和脾组织T细胞亚群，观察胰腺病理、免疫组化和超微 结构变化。结果　20周龄时，FIA对照组的糖尿病总发 病率为73.68%，而GAD组仅为6.25%(P＜0.01 )，发病时 间也明显延缓；GAD组的胰岛炎症分数较FIA组明显降低，且炎症程度减轻(P＜0.05)；GAD组的C-肽水平也明显高于对照组(P＜0.05)；两组的GAD-Ab阳性率无明显差别 ；FIA组的脾脏T细胞以CD+4亚群为主，GAD组则CD+8亚群比例增高，CD4/CD8比 值显著下降(P＜0.01)；免疫组化也表明FIA组胰岛浸润淋巴 细胞为CD+4T细胞，而GAD组胰岛CD+4细胞明显减少，且局限于胰周。结论　猪脑GAD有预防NOD小鼠胰岛炎和糖尿病发生的作用，其机制 可能与改善小鼠缺陷的CD+8T细胞亚群有关。

Glutamic acid decarboxylase prevents type 1 diabetes by regulating the subsets of T lymphocytes in NOD mice

LI U Fang　YU Maohua　ZHU Qiuyu　et al

　　（Department of Endocrinology,Huashan Hospital ,Shanghai medical University,Shanghai 200040）

　　【Abstract】　Objective　To observe whether glutamic acid decarboxylase (GAD) can prevent type 1 diab etes in nonobese diabetic (NOD) mice and to study its influence on the immune sy stem. Methods　One injection was performed intra peritoneally (i.p.) with GAD purified from pig brain, together with Freund incom plete adjuvents (FIA), into female NOD mice at the age of 4 weeks as treated gro up (n=32), other 19 mice were injected FIA 100 μl alone as control group. Diabetes was accelerated 4 weeks later by a single injection of cyclophosphamide. Blood glucose and body weight were me asured weekly. At the age of 20 weeks or 2 weeks after the onset of diabetes, mi ce in two groups were killed and the serum levels of C-peptide and an tibodies against GAD were detected with radioimmunoassay and ELISA respectively. The subsets of T cells in spleen were determined by two-color FACS analysis, t he ultrastructure of β cells was observed, and pancreatic histopathological and immunocytochemical studies were performed using the anti-CD4 or anti-CD8 monoclonal antibodies. Results　Immunization wit h GAD reduced the incidence of diabetes (6.25% vs 73.68%, [ WT9.BX P＜0.01) and delayed its onset as compared with FIA mice at ag e of 20 weeks. The serum C-peptide levels were significantly higher in GAD group th an that in control group (P＜0.05), the lymphocytic inflamma tion of pancreatic islets showed a switch from severe insulitis in control mice to peri-insulitis in GAD-treated mice with the insulitis score decreased marke dly (P＜0.01) in the GAD group. A strong proliferative respo nse of CD+8 subsets in splenocytes occured in GAD group, and the imbalance o f CD4/CD8 ratio in control mice was corrected (P＜0.01). T he lymphocytes infiltrating islets showed a marked reduction of CD+4 T cells , even the small number of CD+4 subsets existed only outside the islets in GAD-immunized mice. The prevalence of GAD antibody showed no significant di fference between these two groups. Conclusion　G ad prevents the onset of type 1 diabetes and reduces the severity of insulitis i n female NOD mice. Its mechanisms seem to be related to the improvement of CD+ 8 T cell deficiency.

　　【Key words】　Glutamate decarboxylase;　　Mice, inbred NOD;　　Diabetes mellitus, insulin-dependent;　　T-lymphocyte subsets

　　非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一种自发性自身免疫性糖 尿病(DM)动物模型〔1〕。近几年国内外已有人应用谷氨酸脱羧酶(GAD)预防1型D M的尝试，表明重组人GAD65、GAD67或其活性肽段对NOD小鼠的1型DM有一定的预防或延缓作 用〔2-6〕。本研究用猪脑GAD早期免疫NOD雌性小鼠，了解其是否具有预防胰岛炎和 糖尿病发生的作用，探讨其可能的作用机制。

　　材料和方法

　　一、材料

　　1.动物：为NOD/Lt种小鼠。种鼠购自北京中科院实验动物研究所。在标准环境条件下饲养， 繁殖出第一代，取雌性小鼠用于实验。

　　2.试剂：GAD由本实验室从猪脑提纯〔7〕，为含GAD65和GAD67的混合物，用时稀 释至1 μg/μl；不完全弗氏佐剂(FIA)为Sigma公司产品。其余试剂均为AR规格。

　　二、方法

　　1.小鼠的分组与处理：4周龄时，选体重＞10g的雌性小鼠编号后分两组用药：(1)FIA对照组 (19只)：生理盐水50 μl与FIA 50 μl混匀后一次性腹腔注射(ip)；(2)GAD免疫组(32只)： GAD 50 μg与FIA 50 μl混匀后i.p.；两组皆于鼠龄8周时环磷酰胺250 mg/kg i.p.一次， 以加速糖尿病；所有小鼠从4周龄开始，每周测定体重、血糖，确诊糖尿病2周后或鼠龄20周 时处死小鼠；死前用摘眼球法取全血，4℃离心分离血清置-20℃保存以备指标测定；小鼠 死后立即取出胰腺，作如下处理：(1)置苦 味酸-多聚甲醛溶液固定24 h，洗涤数次后80%乙醇保存，备做组织病理检查；(2)用OCT包埋，干冰-丙酮法制成组织冻块，置-70℃备做免疫组化；( 3)1.5%戊二醛固定后送电镜观察；同时取胸腺和脾脏用铝箔包裹后置-70℃备用。

　　2.指标测定：用拜耳公司的快速血糖仪测定尾静脉血血糖(BG)，以BG≥13.3 mmol/L且持续1 周以上诊为DM。C-肽测定试剂盒购自天津DPC公司，RIA法测定。GAD-Ab测定试剂盒购自美 国Bi omerica公司，取血清100 μl，用ELISA法测定，结果以＜1.00 ng/ml为阴性；1.00～1.05 ng/ml之间 为可疑阳性；＞1.05 ng/ml则为阳性。

　　3.脾组织T细胞亚群测定：将脾脏制成单核细胞悬液，每管加抗-小鼠CD4或CD8单抗1 μl，4℃孵育45 min后；取1×106个细胞上流式细胞仪，由中科院细胞所协助进行T细胞 亚群计数，结果以百分比表示。

　　4.胰岛病理学观察：胰腺经石蜡包埋后切片，常规苏木素-伊红(HE)染色。由 三位病理专业人员盲法读片，分别计数5只小鼠的胰小岛数目，并采用国外标准进行胰岛炎 评分及分级〔4-8〕。胰岛炎分数：每只鼠胰切片在镜下随机计数5～10个胰岛分值 ，无胰岛炎，为0；50%有炎症，为0.50；100%胰岛有炎症，为1。分级标准：仅有胰岛周围 淋巴细胞浸润为一级(即胰周围炎)；浸润至胰岛内，但浸润程度＜50%者，为二级；浸润程 度＞50%者，为三级。

　　5.胰岛浸润淋巴细胞的免疫组织化学：(1)制作冰冻切片；(2)丙酮液固定10 min，PBS(50 m mol/L，pH 7.2)洗涤3次；(3)加生物素化CD4(1:120稀释)或CD8(1:200稀释)单抗50 μl ，37℃温育60 min；(4)浸于0.1%过氧化氢液，室温放置20 min；(5)加ABC(1:100稀释)50 μl，37℃温育30 min；(6)加0.5 mg/ml DAB 50 μl，显色5～8 min；(7)苏木素复染，封 片。同时做连续切片的HE对照染色。

　　6.胰腺超微结构观察：由上海医科大学电镜室协助完成。

　　7.统计学处理：各指标检测结果均以±s表示，用t检验或样本率的u检验法对结果进行显著性分析。

　　结　　果

　　一、预先用GAD免疫对NOD小鼠胰岛炎和糖尿病的影响

　　1.糖尿病发病率：在20周的观察期内，GAD组仅有2例小鼠发生糖尿病，总发病率6.25%，比 相应的FIA　对照组发　病率(73.68%)显著降低(P＜0.01)(图 1)。

　　2.胰岛炎：胰腺组织学检查结果显示，雌性NOD小鼠4周龄时胰岛即开始有淋巴细胞浸润；20 周时，FIA对照组胰岛数目明显减少〔(3.1±1.8)个/只小鼠〕，残　存胰岛的炎症分数为　0.69±0.05，且(87.4±15.4)%为二、三级胰岛炎，血清C- 肽水平很低〔(1.19±1.22)ng/ml〕；而GAD免疫组胰岛数目〔(9.0±2.5)个/只小鼠〕明 显多于对照组(P＜0.05)，胰　岛炎分数降　 至0.08±0.01(P＜0.05)，且炎症胰岛中(95.7±3.6)%为胰周围炎，仅(4. 17±2.73)%为二级；无　一例达到　三级者；血清C-肽〔(2.41±0.93)ng/ml〕　也明显高于前者　(P＜0.05)。

图1　GAD组和FIA组小鼠糖尿病 累积发病率变化

　　Fig 1　Cumulative incid ence of diabetes in female NOD mice tolerized with GAD in FIA and FIA alone

　　二、胰岛β细胞超微结构的变化

　　透射电镜下将胰组织放大5　　000～10　　000倍后观察胰岛周 围及内部的超微结构，结果显示：对照组 患病鼠未找到胰小岛，即使未发病小鼠，也难以找到胰岛，且残存胰岛的β细胞，内部有胞 核核膜扩张，胞浆中有大量内浆网扩张及其内部核糖体脱颗粒，分泌颗粒的数量少、分布紊 乱、且有空泡样变等异常变化；边缘有淋巴细胞存在，且其膜足突已伸入β细胞膜，使β细 胞胞膜受损；胰岛内外分泌交界处也有大量淋巴细胞存在。GAD预免疫组β细胞的核膜无 扩张；胞浆中内浆网无扩张及脱颗粒；分泌颗粒多，无异常空泡样变；β细胞边缘胞膜结构 完整，无淋巴细胞存在；胰岛内外分泌交界处的界膜完整，内外分泌细胞间也无淋巴细胞出 现。

　　三、GAD腹腔注入对血清GAD-Ab的影响

　　测定两组小鼠血清GAD-Ab的结果显示，GAD组与FIA组的GAD-Ab水平分别为〔(0.55±0.65 )和(0.85±1.01)ng/ml〕、阳　性率　( 14.28% vs 18.75%)两组之间差异无显著性(P＞0.05)。

　　四、GAD免疫后脾脏T淋巴细胞亚群的变化

　　脾脏淋巴细胞测定结果显示，对照组与GAD组的T细胞CD+4　亚群分别为　 78.35±10.11与30.75±14.79(P＜0.01)，CD+8亚群分别为22.16±11. 04与69.48±14.81(P＜0.01)，CD+4/CD+8亚群比值，[ QS) 分　别为　3.34±2.83　与　0.31±2 .83(P＜0.01)。对照组的T细胞以CD+4亚群为主，而CD+8亚群比例 低；GAD组则以CD+8细胞亚群比例升高，CD+4/CD+8亚群比值明显下降。

　　五、GAD免疫后胰岛浸润淋巴细胞的免疫组织化学改变

　　用CD4、CD8单抗对两组胰腺免疫组化染色的结果表明，与外周淋巴器官有CD+4T细 胞增生性反应一样，对照组的胰岛炎症细胞也几乎全部为CD+4的T细胞，大量分布于胰 岛周围及内部；GAD组浸润胰岛的CD+4T细胞数量明显减少，且分布限于胰周。两组的CD 8细胞染色均为阴性。

　　讨　　论

　　本研究给予4周龄雌性NOD小鼠腹腔注射纯化猪脑GAD，在20周的观察期内，可保护绝大多数( 90%以上)小鼠不发展为糖尿病，且胰岛炎症程度显著减轻；而单独注入FIA则对糖尿病发病 无明显影响；胰岛病理学结果显示GAD预免疫组小鼠的胰岛数目保存较好，且胰岛炎症被局 限在胰周；而对照组胰岛绝对数目减少，炎症出现率100%，且其中80%以上为二、三级胰岛 炎 。这与国外报道一致〔2-6〕，提示早期应用GAD具有预防NOD小鼠DM发病的作用。另 外，本研究在国内外首次对FIA对照组及GAD组胰腺进行了电镜观察，结果显示胰岛β细胞的 分泌颗粒、内浆网、核膜等超微结构得到了保护，不象对照组的胰 岛β细胞有分泌颗粒减少、空泡样变和内浆网及核膜扩张、核糖体脱颗粒等异常变化。上述 结果提示GAD预免疫不仅可预防NOD小鼠糖尿病发病，防止胰岛细胞的胰岛炎等其它自身免疫 现象，且可保护β细胞的超微结构，即使在应用环磷酰胺加速的情况下也如此。

　　近几年随着对1型DM动物模型(如BB大鼠和NOD小鼠等)和患者进行的大量基础研究，大大加深 了对1型DM病因和发病机制的认识。现认为1型DM的发病包括辅助T细胞(CD+4Th细胞) 活性增强和抑制性T细胞(CD+8Ts细胞)缺陷两个方面。这造成免疫调节失控和细胞因 子 不平衡，以分泌IL-2、IFN-γ等因子的Th1细胞占优势，从而使免疫反应扩大 〔8〕。本研究表明，在FIA对照组的外周淋巴器官脾脏中及胰岛炎症细胞中，不管是否 用环磷酰胺加速，皆自发性存在CD+4T细胞比例增多而CD+8T细胞亚群降低反应，这 与以前 报道的NOD小鼠1型DM发病为CD+8的Ts细胞亚群缺陷一致；用GAD免疫的小鼠脾组织中 淋巴细胞则以CD+8T细胞亚群为主，CD+4/CD+8亚群比例下降甚至倒转；免疫组 化结果直观地显示对照组胰岛浸润的淋巴细胞绝大多数为CD+4T细胞，提示该细胞可能 直接参与了β细胞的损伤过程；而GAD组胰腺组织中的CD+4T细胞数减少；这提示注入提 纯猪脑GAD预防NOD小鼠发生DM的机制之一，可能与恢复Ts(CD+8)细胞的功能、抑制 CD+4T细胞(Th)的增生及活动，使免疫抑制作用加强，从 而纠正免疫失控状态有关。这使T细胞介导的自身免疫性β细胞损坏过程中断，从而保护了 β细胞。由于环磷酰胺加速糖尿病的机制在于：(1)取消Ts细胞的功能；(2)使CD+4T h亚群向Th1方向分化，IFN-γ产生增加，介导针对β细胞的细胞免疫反应〔9 〕。故外源性GAD在影响NOD雌性小鼠自发性自身免疫反应的同时，也可能通过上述机制拮 抗环磷酰胺的致糖尿病作用。

　　人类新发病的1型糖尿病患者中，70%左右可检测到GAD65 Ab和T细胞增生的反应〔 1，10，11〕，针对胰岛GAD的反应最早出现在疾病临床发病前几年甚至十几年〔2〕 ，然 而，目前尚不清楚对GAD的免疫反应是β细胞破坏的原因还是结果，本研究也表明早期给予 含GAD65和GAD67两种分子形式的GAD，可几乎完全中止针对胰岛的细胞免疫反应，反过来提 示GAD自身免疫反应在NOD小鼠DM早期的发生发展中可能起启动作用。因此，用不同种类和来 源的GAD预先对NOD小鼠免疫，皆可预防或延缓其糖尿病发病，而用其他β细胞抗原如ICA512 (IA-2)早期注入却无此保护作用〔1〕，这提示GAD是参与NOD小鼠糖尿病早期发病机 制的一个关键靶抗原。但外源性GAD注入也可能不被机体耐受，反而诱使糖尿病发生或加重 〔12〕。本研究表明20周龄时对照组NOD小鼠血 中GAD-Ab阳性率与GAD组无明显差别。这提示用腹腔注射法给NOD小鼠应用该剂量的猪脑GAD 不会使小鼠自身的体液免疫反应加重而诱发DM。

　　总之，本研究表明猪脑GAD有预防NOD小鼠1型DM、保护β细胞超微结构的作用，其机制可能 与调节T细胞亚群有关。由于猪脑GAD来源广、价格低，有望用作预防人类自身免疫性糖尿病 的抗原。

　　作者单位：朱禧星（上海医科大学附属华 山医院内分泌科　200040）

　　钟慈声（上海医科大学电镜室 ）

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