念珠菌对唑类抗真菌药耐药机理及基相关因素的研究进展

    摘要 唑类抗真菌药耐药的念珠菌株呈现增多趋势，许多学者从不同方面进行了研究。综述念珠菌对唑类药物的耐药现象和耐药产生的相关因素，以及对耐药机理从基因水平进行研究的新进展。

　　随着抗真菌药的临床应用，耐药菌株逐渐产生。近年来有关对真菌药物耐受的念珠菌报道增多，已引起医学界和药学界广泛关注，许多学者对此进行了深入探讨和研究。

　　一、念珠菌对唑类药物的耐药现象

　　（一）耐药菌株的增多与传播：HIV感染、器官移植、恶性肿瘤患者，由于免疫功能低下或抑制，易伴发条件致病性感染特别是真菌感染，60%～80%艾滋病患者有一种或几种真菌感染。唑类药物广泛用于临床治疗和预防，由于长期反复和大剂量应用，耐药菌株和发生率日趋升高。据报道法国Pasteur医院和其它几个研究中心1994年分离自艾滋病患者的念珠菌株10%对氟康唑耐药[1]。而新近的统计资料显示，在艾滋病患者口咽感染念珠菌中，33％以上是耐药菌株，对氟康唑的最小抑菌浓度（MIC）＞12.5μg/ml（敏感菌株MIC值一般＜4μg/ml）[2]。

　　Dromer等报道在10对已保持性关系专一并稳定1年以上的HIV阳性伴念珠菌感染的患者中，有13例口咽分离的感染菌株对氟康唑耐药。从未用过唑类药物的5例患者，其性伴感染的念珠菌株却均对氟康唑有耐药性。进一步通过DNA限制性片段长度多态分析（RFLP）发现，这些感染菌株具有很近的种系关系，上述10对性伴中有6对的分离菌具有一个以上的相同克隆片段，因此可认为耐药菌株可以通过性伴传播[3]。

　　（二）耐药菌株对唑类药物具有交叉耐药性：He xiaoGang对分离自HIV感染者的212株白念珠菌（以下简称白念）研究发现，多数菌株对氟康唑敏感，MIC值＜2μg/ml,这些菌株对伊曲康唑的MIC50及MIC90值也相应较低,范围在0.05μg～0.1μg/ml之间。另有61株对氟康唑敏感性较差，其MIC值为4μg～62μg/ml,MIC50及MIC90值分别是8μg/ml、64μg/ml；同时测得伊曲康唑对这些菌株的MIC50和MIC90值分别是0.2μg/ml和0.4μg/ml。由此可见，这些菌株不但对氟康唑不敏感，对伊曲康唑的MIC50和MIC90值也相应增高了约4倍。尽管临床上尚未证实唑类药物间的交叉耐药性，但这项实验室研究结果显示了氟康唑与伊曲康唑间的交叉耐药现象[4]。另有研究结果也支持这一论点，并进一步指出靶酶编码基因和膜上转运泵编码基因的突变、缺失和过分表达是交叉耐药产生的物质基础[5]。

　　（三）耐药现象导致了感染菌种的变迁：Price等对美国一家医院1987至1992年5年间分离的念珠菌进行氟康唑体外敏感试验，并对血标本中菌种的分布进行了氟康唑使用前后对比研究，发现MIC值具有明显的种间差异，白念对氟康唑最敏感，而光滑念珠菌敏感性最差。这一结果与５年间菌血症致病菌种的变迁相一致。在氟康唑使用前和使用初期，白念感染率为87%，但到1992年（氟康唑已广泛应用）只占感染菌株的31%。在此期间，光滑念珠菌的感染率由2%升到26%；热带念珠菌从2%升到24%；克柔念珠菌从9%升到20%。由此可见，随着氟康唑广泛应用，导致了念珠菌菌血症致病菌向非白念的变迁[6]。然而并非所有学者认为临床治疗可导致酵母感染菌种变迁。Sobel在10余年的临床实践中，对许多念珠菌性阴道炎患者尽管长期给予酮康唑治疗，但并未发现引起阴道炎的酵母菌种发生改变[7]。

　　二、念珠菌对唑类药物产生耐药的相关因素

　　（一）细胞免疫低下或缺陷易导致耐药菌株产生：对伴口咽念珠菌感染的HIV患者研究发现，细胞免疫降低者对念珠菌有易感性，同时在这些患者身上也易发生耐药现象。在临床治疗失败的病例中，测其MIC值明显升高，且在CD4细胞数＜20μl患者身上耐药显著高发，提示耐药的产生除与氟康唑的长期应用有关外，CD4细胞数减少更易产生耐药菌株[8]。Redding观察1例反复发生口咽念株菌感染的患者，在2年反复14次治疗中，氟康唑有效量由100mg/d快速升至800mg/d，MIC值亦由0.25μg/ml上升到＞64μg/ml。其间测得患者CD4细胞数是9/μl。在第15次再次发病时，氟康唑800mg/d已经无效[9]。有学者推断，免疫系统严重缺陷可能阻止抗真菌药物效应的正常发挥。

　　（二）药物与机体感染状况对念珠菌耐药有诱导作用：Vuffray等对口服氟康唑150mg/d已耐药的口咽念珠菌感染的HIV患者改用更高剂量，其中91例次治疗失败者既往用药的平均累积量是10600mg,而119例次治疗有效的平均累积量是4400mg。两者用药累积量有显著性差异（P＜0.001）。提示药物的应用与菌株耐药的产生密切相关[10]。Cameron等随机选择87例HIV阳性患者分组研究，对其中22例有口咽或食管感染症状和17例无症状的白念分离菌株进行唑类药敏感试验（两组患者均有唑类药应用史），两组MIC值有非常显著性差异（P＜0.0001）；前者高于后者。接着又对分别来自未经唑类药治疗的无症状和有症状患者的分离菌株进行MIC值对比分析，其P值＜0.0001，有症状者显著高于无症状者。以上研究结果显示药物应用史和感染症状与唑类药物对其致病菌株的MIC值升高显著相关。作者又对其余非白念菌株进行上述对比研究，结论相同[11]。

　　（三）菌株的耐药性可能经遗传获得：挪威学者对13株挪威念珠菌进行氟康唑药敏试验，其中11株分离自1990至1996年门诊就医的8例恶性病患者，其中仅2例有氟康唑治疗史，另2株为60年前的保藏菌。结果对所有菌株MIC值均＞32μg/ml。60年前的保藏菌株和未经治疗者的致病菌株亦出现耐药现象，提示耐药并非均为唑类药物应用所诱导，菌株的耐药性很可能具有遗传性[12]。有研究推测这些耐药表型至少可以稳定600代[13]。

　　因而，患者最初感染的可能即为具有遗传稳定性的耐药菌株，也可能在长期唑类药临床应用中由敏感菌株突变成为耐药菌株。耐药的产生与许多已知和未知的因素有关，但药物的长期反复治疗和预防应用起着关键作用。因此有学者指出应最大限度地避免上述用药方式。并提出两条防止和延缓耐药产生的措施：①短期大剂量用药以尽快有效地杀灭真菌，降低耐药突变的发生率。②对于唑类耐药的菌株，除了加大剂量外，适时换用其它药物也是非常必要的[14]。

　　三、念珠菌对唑类药物的耐药机理

　　迄今为止，多数学者认为念珠菌对唑类药物的耐药主要通过以下三条途径：①细胞膜对唑类药物通透性改变，细胞摄取和蓄积的药物量降低。②药物作用的靶酶C-14去甲基化酶（14DM）产生过多。③靶酶对药物的亲和力降低。后二条可归纳为唑类药物作用靶酶的改变。通常认为，膜通透性的改变起更重要的作用。有学者对敏感和耐药的光滑念珠菌研究发现，对3H标记的氟康唑，敏感菌株摄入率是0.33±0.02pmol/min，耐药菌株几乎不能显示荧光摄入。同时测两者IC50（50% inhibition of incorporation）值相近，IC50反映药物对靶酶抑制作用，靶酶改变无明显差异。说明膜通透性改变在耐药产生中起关键作用[15]。

　　（一）对靶酶变化的研究：唑类药物作用的靶酸是膜成分麦角固醇合成中不可缺少的中间合成酶，唑类药物对此具有强的亲和性，从而抑制酶的催化活性，麦角固醇合成受阻，胞膜结构破坏，真菌生长抑制。靶酶结构改变以及其过度表达均可导致念珠菌耐药，许多学者对这一耐药机理进行了研究。

　　从理论上讲，靶酶编码基因Erg16的扩增可致其过度表达。Sanglard等人用URA3-14DM杂交基因探针对分离自5例艾滋病患者的16株白念进行DNA分析，结果无论耐药还是敏感菌株，其靶酶基因Erg16的拷贝数均无变化。因而推测靶酶的过度表达并非由基因Erg16的扩增所致。Sanglard又采用Northern blot方法对耐药和敏感菌株靶酶的mRNA含量进行测定。发现大部分mRNA含量高的菌株，其MIC值相应增高。但有1株靶酶mRNA含量高的菌株，MIC值却显著低于另1株mRNA含量低的菌株。因而仅用靶酶mRNA含量升高只能部分地解释耐药现象的产生[16]。由靶酶过分表达而耐唑类药物的实验室依据有待进一步深入探讨。

　　White曾对17株白念Erg16基因进行分析，该基因含有始动区域的5个片段（PA～PE），编码区域的7个片段和终止区域的3个片段（TA～TC）。利用PCR-SSCP技术对这些片段扩增后行序列分析。与敏感菌株相对照，耐药菌株在编码区域第7片段近3'端的1547位点发生碱基突变，鸟嘌呤（G）由腺嘌呤（A）取代，相应地Erg16编码蛋白质也发生改变，位于467位点的精氨酸（Arg）由赖氨酸（Lys）替代。这一位点正处于靶酶的活性中心，它改变了酶的活性，也引起菌株对唑类的耐药。对PE片段位点-367至-284序列分析发现，耐药菌株可以有多处等位基因异质性（heterogenicity），并在-284位点有等位基因缺失突变。推测可能与基因重组和基因转换有关，这些突变基因与菌株对唑类耐药有关[17]。

　　（二）细胞膜对唑类药物通透性改变是真菌耐药的一个主要因素：有实验测知敏感白念菌株胞内唑类浓度是胞外的2.5倍以上，而耐药菌株胞内仅是胞外的1/2。耐药菌株膜通透性的改变，主要依赖膜上两种蛋白泵的功能改变。一种泵是ATP能量依赖型的多药载体（亦称ABC transporters） ，进行能量依赖的主动运输；另一种泵简称BEN，通过电化学势能进行被动运输，属于非能量依赖型载体。这两种与耐药有关的载体被划属于ABC超家族和MF超家族[16]。这两种泵将细胞内物质转运到细胞外。研究发现，膜对唑类通透性降低不是由于药物摄入的减少，而是由胞内泵出药物的增多，即两种泵功能的增强与耐药密切相关。

　　有学者对这两种蛋白泵的基因进行分析，在分离自5例艾滋病患者的17株白念中，菌株2号、3号、16号、17号的MIC值较基余菌株有明显升高。用斑点杂交的方法检测两种蛋白泵基因CDR（编码ABC蛋白泵）和MDR（编码BEN蛋白泵）的mRNA水平。结果CDR的mRNA水平在16和17号菌株比在1～15号菌株约增高5倍。MDR的mRNA水平基本呈现随MIC值而升高的趋势，第1株反映mRNA水平的荧光信号很弱，mRNA水平很低，2号和3号菌株荧光信号大大增强，mRNA水平分别是1号的12倍和25倍。因此推测蛋白泵的mRNA水平升高是耐药的分子生物学改变[5]。进一步分析认为转录水平的升高和mRNA加帽和多聚尾的修饰改变可能是mRNA含量升高的主要原因。也有学者认为一些开放阅读框架（ORFs，编码氨基酸的三联体长链，无终止密码子，是基因存在的区域）可能与ABC和MF两家族的基因编码有关。Alarco的研究结果显示对白念MF家族的编码基因BEN的启动子AP1的过分表达可致菌株耐药，但开放阅读框架有缺失突变时该菌株的耐药性可被大大地抑制或消失。FLR1（Fluconazole resistance 1）的表达又受AP1蛋白的调节，FLR1的表达可被AP1的过分表达所诱导。因而FLR1，这个编码MF家族多药载体的开放阅读框架可能是受AP1蛋白调控的一种决定菌株耐药性的分子因素[18]。

　　上述研究显示，在菌株产生耐药过程中，可能通过三条耐药途径，也可能主要通过一条途径。但耐药机理的阐明尚需多方面拓宽和深入研究。
   
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