雄激素对良性前列腺增生组织中Bcl-2 mRNA表达的影响

　　摘　要：目的　研究雄激素水平对良性前列腺增生（BPH）组织中凋亡抑制基因Bcl-2 mRNA表达的影响。　方法　分别通过服用药物和切除睾丸改变BPH患者和大鼠机体雄激素水平，采用mRNA斑点杂交技术，检测不同雄激素水平下的人BPH组织和大鼠前列腺组织Bcl-2 mRNA的表达情况。　结果　在所有20例人BPH组织中，Bcl-2 mRNA表达均呈阳性，未服药对照组Bcl-2 mRNA杂交斑点积分光密度值（IOD值）是服药组的1.71倍（P＜0.01）；正常对照组大鼠前列腺组织Bcl-2mRNA杂交斑点IOD值是去势组的1.28倍(P＜0.05)。　结论　抗凋亡基因Bcl-2的表达与BPH的发生有关，前列腺细胞凋亡的减少可能是BPH发病的重要原因之一。雄激素在BPH的发病中除了促进前列腺上皮和间质的增殖外，也可能通过促进Bcl-2的表达，抑制细胞凋亡而发挥作用。

Influence of androgen on Bcl-2 mRNA expression in BPH tissue

WANG Xiaofeng, YE Haiyun, JIANG Hui

　　（Department of Urology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044, China.）

　　Abstract：Objective　To study the expression of Bcl-2 mRNA in BPH tissue and the influence of androgen.　Methods　The circulating testosterone level of BPH patients and rats was decreased by administration of medroxyprogesterone and stilbestrol as well as castration. Using RNA dot blot hybridization technic, we detected the Bcl-2mRNA expression in human BPH tissue and rat prostate under different level of androgen.　Results　The average dot IOD（integrated optical density, IOD） value ratio of the untreated patient group to the treated group was 1.71 (P＜0.01).There was an decrease of intensity of Bcl-2 mRNA expression in the latter group compared with the former group. The ratio of the normal rat prostates to the castrated rat prostates was 1.28 (P＜0.05). The Bcl-2 mRNA expression was decreased after castration.　Conclusions　The expression of Bcl-2 plays a role in the development of BPH. The decrease of prostatic cell death is important in the BPH pathogenesis. Apart from promoting the proliferation of prostatic epithelia and stroma cells, androgen might prohibit apoptosis by increasing the expression of Bcl-2 in BPH development.

　　Key word：Prostatic hypertrophy;　Androgens；　Gene expression

　　良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia, BPH）是影响中老年男性健康的主要疾病之一。一般认为，年龄增长和有功能睾丸是BPH发病的必需因素，并相继提出了“双氢睾酮学说”、“胚胎再唤醒学说”和“肽类生长因子相互作用学说”。细胞凋亡的概念提出后，人们认为细胞凋亡的减少可能也是BPH发病的重要原因之一。为研究雄激素水平对抗凋亡基因Bcl-2 mRNA在BPH组织中表达的影响，我们采用RNA斑点杂交方法检测了不同雄激素水平下Bcl-2 mRNA在BPH组织和大鼠前列腺组织中的表达情况。

　　资料与方法

　　1．前列腺标本：本院20例良性前列腺增生组织标本，其中10例患者于术前1周每日口服己烯雌酚2 mg、甲孕酮120 mg，连续7 d；10例对照组患者术前未用药。BPH组织由开放手术获得，全部标本经病理证实。20只健康雄性大鼠（体重240～270 g）由国家计划生育委员会科研所动物室提供。其中10只大鼠处死前4 d切除双侧睾丸，10只对照组大鼠未行睾丸切除。大鼠用断颈法处死后，摘取前列腺组织置液氮中保存。

　　2．探针质粒和转化态菌：Bcl-2探针质粒（DNA序列为1886 bp，整合于plx-Sn质粒中，具Ecor-I特异酶切位点）由北京医科大学人民医院王申五教授惠赠；转化态菌（Mc1061）由本院中心实验室提供。

　　3．Bcl-2探针的制备：提取和纯化Bcl-2质粒DNA；Ecor-I酶切Bcl-2质粒DNA；0.8%琼脂糖凝胶电泳分离；液氮冻融法回收Bcl-2 DNA片段；随机引物荧光素标记系统(Renaissance)标记Bcl-2DNA片段，完成Bcl-2探针的制备。

　　4．前列腺组织RNA的提取：取液氮保存的人BPH组织或大鼠前列腺0.5 g，加1 ml异硫氰酸胍变性液充分匀浆；水饱和酚、氯仿/异戊醇抽提；等体积的异丙醇沉淀；75%乙醇洗两次后溶于DEPC水；紫外分光光度计测定RNA浓度。

　　5．RNA斑点杂交分析：提取的RNA（1 μg/μl）点于硝酸纤维素膜上，同时以点膜稀释液作空白对照，未标记的Bcl-2 DNA作阳性对照；65 ℃预杂交1 h；加入杂交液（探针浓度约为20 ng/μl），65 ℃振摇过夜；抗体结合液温和振洗1 h；CDP-Star液(购自美国杜邦公司)盖过膜5 min；暗室中加过感光胶片曝光10 min显影定影后，经计算机图像扫描仪测定杂交斑点IOD值，比较分析结果。

　　结果

　　1．BPH患者服用甲孕酮、己烯雌酚前后血清睾酮的测定结果：采用放免法检测BPH患者服药前和服药后第7天血清睾酮水平，平均睾酮浓度自服药前的308.6 mg/L降至服药后的43.5 mg/L(P＜0.01，n=10)，说明通过服用药物达到了有效降低机体雄激素水平的目的。

　　2．服用己烯雌酚、甲孕酮对Bcl-2 mRNA在BPH组织中表达的影响：10例BPH患者术前服用药物1周，另10例对照组患者术前未服药，摘除前列腺组织提取RNA，随机配对点膜行Bcl-2 RNA斑点杂交分析。对杂交斑点测定IOD值，对照组BPH组织Bcl-2mRNA杂交斑点IOD值是服药组的1.71倍（P＜0.01，n=10，双侧配对t检验）。

　　3．睾丸切除对Bcl-2mRNA在大鼠前列腺组织中表达的影响：10只双侧睾丸切除组大鼠前列腺RNA和10只对照组大鼠前列腺RNA随机配对行Bcl-2 RNA斑点杂交分析。对杂交斑点测定IOD值，对照组大鼠前列腺组织Bcl-2mRNA杂交斑点IOD值是双侧睾丸切除组的1.28倍（P＜0.05，n=10，双侧配对t检验）。

　　讨论

　　传统观点认为良性前列腺增生是前列腺各种细胞成分无控制生长所致。然而一些实验证实在BPH组织中很少见到有丝分裂相细胞，实验诱导的BPH动物模型中，尽管前列腺体积增加了4倍，但DNA合成率与对照组相比却下降了33%，因而推测BPH可能不仅是细胞增殖的增加，细胞凋亡的减少可能更为重要。

　　Bcl-2基因是Tsujimoto等［1］于1984年在大多数滤泡型非何杰金B细胞淋巴瘤中首先发现的。正常Bcl-2基因位于18q21染色体上，该基因有3个外显子和2个启动子［2］。Bcl-2最初是作为一种原癌基因被认识的。但后来的研究发现Bcl-2本身无促增殖作用，也无促恶性转化作用。目前认为Bcl-2具有抑制细胞凋亡的能力。人胚胎前列腺所有上皮细胞均有Bcl-2蛋白的表达。成人BPH组织中Bcl-2蛋白主要分布于基底细胞。BPH组织中Bcl-2蛋白分布于基底细胞和大部分腔上皮细胞，表达强度高于正常前列腺［3］。以上一系列研究初步显示了Bcl-2可能与前列腺发育、正常前列腺形态和功能的维持以及BPH发病有关系。

　　雄激素减少或消失可以导致前列腺萎缩，细胞发生凋亡，但雄激素通过何种途径诱发细胞凋亡目前还不清楚。为研究BPH组织和Bcl-2的关系，我们分别通过服用药物和切除睾丸降低人BPH患者和雄性大鼠机体雄激素水平。测定服药前后BPH患者血清睾酮浓度，结果显示服药后平均血清睾酮较服药前明显下降，从服药前的308.6 mg/L降至服药后的43.5 mg/L。有文献报道大鼠睾丸切除后6小时，血清睾酮即显著下降，睾丸切除后第3天达最低水平，在切除后第4天，大鼠前列腺细胞的凋亡达到最高峰［4］。我们在去势后第4天处死大鼠，检测前列腺Bcl-2mRNA的表达。研究显示对照组BPH组织Bcl-2mRNA杂交斑点IOD值是服药组的1.71倍，说明BPH患者在降低雄激素水平后Bcl-2mRNA表达降低；在动物实验中亦得到相同的结果，对照组大鼠前列腺组织Bcl-2mRNA杂交斑点IOD值是双侧睾丸切除组的1.28倍。结果提示，雄激素在BPH的发病中除了促进前列腺上皮细胞和间质细胞的增殖外也可能通过增加Bcl-2的表达，抑制前列腺细胞的凋亡而发生作用。在BPH中，雄激素如何影响Bcl-2表达的组织分布，其间的信号传递通路是什么及存在哪些调控因素等问题则需作进一步研究。

　　参考文献：

　　［1］Tsujimoto Y, Finger LR, Yunis J, et al. Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14,18) chromosome translocation. Science, 1984, 226:1097-1101.

　　［2］Hockenbery DM. Bcl-2, a novel regulator of cell death. Biol Essays, 1995,17:630-633.

　　［3］邓方明，顾方六，夏同礼. 癌蛋白Bcl-2在前列腺增生组织中的表达及其意义. 中华泌尿外科杂志, 1995, 16:729-732.

　　［4］Kyprianou N, Isaacs JT. Activation of programmed cell death in the rat ventral prostate after castration. Endocrinology, 1988,122:552-556.