异种移植的新进展

　　经过40多年的发展，临床同种器官移植已经成为治疗末期肾脏功能衰竭的有效方法，随着肾脏成功率的提高，出现了供体器官短缺的现象。英国1995年共施行了1800例肾脏移植手术，而实际需要移植的病人多达5000人以上，每年都有许多病人由于没有获得合适的器官而死亡。解决这个问题的方法是增加器官的来源，可以从脑死亡以外的供体获得器官，但技术上的可行性及社会的接受程度使之难以施行，应用机械或生物工程器官也仅仅处于设想阶段。

　　目前解决器官短缺的最有效方法是应用从合适动物供体获得的异种移植物。灵长类器官移植到人的研究工作从本世纪60年代就已经开始了，虽然灵长类与人的亲缘关系较近，但由于其生长周期长，价格昂贵等原因，使得猪成为了目前异种移植的主要来源，肝脏、心脏和胰腺的移植都获得了初步的成功，但由于较远的种系间关系，人对猪的器官会发生强烈的排斥反应。

　　1 超急异种移植物排斥反应（HAR）

　　1.1概述 HAR通常在移植器官血管再通后数分钟内发生，以间质血和弥漫性血栓形成的特征。HAR一旦发生会不可逆地在数分钟到数小时内导致移植失败。HAR的发生反映了受体与供体在种生活费发生上较远的关系，两者被称为不协调的物种，如猪和人[1]。但种系关系并不是唯一的决定因素，例如狒狒和人是协调的物种，如果血型没有相配，狒狒的器官在人体内也会发生HAR；另外，不同的器官对HAR的易感染程度也不一致，肝脏和肺脏较不容易发生HAR。目前研究认为，人类或灵长类对猪的器官发生HAR主要基于以现两个原因：⑴受体的异种反应性自然抗体（XNA）与移植物血管内皮细胞（EC）上的抗原相结合；⑵与受体补体系统不相容的移植物产生的补体调节蛋白人去了对补体激活过程的调控作用。

　　1.2 异种反应性自然抗体存在于人体内与猪内皮细胞表面异种抗原发性特异性结合的抗体被称为异种反应性抗体，它是预先存在于体内而不需受体对异源性抗原致敏产生的抗体。XNA发现于1984年[2]，它可以与胃肠道细菌表面的LPS及其它细胞壁成分结合，发挥抗感染作用，后来发现在人的异种排斥反应中起重要作用。80%的人类XNA所识别猪的抗原是同一种结构——Galα-3Gal。合成Galα-3Gal需要α1，3乳糖转移酶来催化，这种酶存在于所有低等哺乳动物和美洲的猴子细胞中，而人类、猿及欧亚非洲猴子的细胞不表达α1，3乳糖转移酶及相应的糖，因而会存在针对这种糖的抗体。Good等[3]首先证明了Galα-3Gal在异种排斥反应中的重要性，他发现人抗猪细胞的特异性血清可被纯化的乳糖所阻断，例如Galα-3Gal在异种排斥反应中的重要性，他发现人抗猪细胞的特异性血清可被纯化的乳糖所阻断，例如Galα-3Gal，但其他糖类却没有这个作用。Sandrin[4]进一步证明转染α1，3乳糖酶cDNA的COS细胞表达Galα-3Gal，并在XNA及补体的共同作用下导致细胞损伤。Collins[5]证明去除Galα-3Gal的猪细胞对人的XNA及补体具有抵抗作用。在最初的研究中认为XNA主要由IgG构成，在人体约有1%的IgG是XNA。但随后的研究发现在猪一灵类的移植中，XNA主要是IgM而不是IgG。在异种移植物的排斥中，IgM先于IgG特性的与Galα-3Gal相结合，并可在猪在内皮细胞上激活补体。将大量人的IgG注入接受猪心移植的灵长类动物体内并不能引起HAR，目前认为IgGXNA虽不能在HAR中发挥作用，但它在随后发生的IgG介导的细胞排斥反应中起重要作用。

　　1.3 补体的作用 目前研究已证明，HAR发生完全依赖于补体的激活，经典途径和替途径都可单独激活并参与异种排斥反应[6]。在一些协调的异种移植动物模型中，如豚鼠-大鼠、猪-狗，补体的激活通过替代途径，不需要XNA的参与；而在猪一灵长类的异种移植中，补体通过经典途径激活，需要XNA的参与。补体激活过程需要一些调节因子的调控，如促衰变因子（DAF）等。但这些内源性的补体调节蛋白具有种属特异性，发生在异种移植内的补体激活反应不受这些异种蛋白的调控，使排斥反应加剧。这表明受体秘史限制的补体调节蛋白与HAR的发生有很大关系，最近的试验表明一旦补体调节蛋白不相容性得以解决，异种移植的存活时间可以明显延长[7]。

　　1.4 HAR的发病机制 HAR的发病机制与ABO血型不相配合的同种排斥反应相类似。HAR由补体终末成分介导，Brauer[8]发现对豚鼠心脏的HAR不发生于C缺乏的大鼠。膜攻击复合体（MAC）会引起内皮细胞的损伤，血管内容物泄漏及血小板暴露于皮下基质，随后导致血栓的形成。在HAR的早期，补体终末成份的非细胞毒性作用使内皮细胞功能丧失。内皮细胞功能受损的原因这一是细胞形状改变，Cb67与内皮细胞结合导致细胞间的“裂隙”形成，这个“裂隙”直径约5μm，破坏了血管内容物与血管的基质并被激尖。另一个引起AHR的机制可能是内皮细胞表面硫酸乙酰肝素的丧失[9]，硫酸乙酰肝素是一种多糖蛋白聚合物，与许多内皮细胞功能有关，是EC与血管蛋白之间的屏障，具有抗凝、保护EC不受氧化剂及补体损伤的作用。在EC与抗体及补体作用几分钟之内，就有大量的硫酸乙酰肝素从内皮细胞表面丧失，这个过程是C5a介导完成的，其他补体成分没有参与。XNA、补体及内皮细胞的活化使HAR发生，这个过程被称为不依赖蛋白合成的Ⅰ型内皮细胞激活[10]。

　　2 迟发异种移植物排斥反应（DXR）

　　2.1 概述 DXR又称急性血管性排斥反应，一旦HAR得以避免，例如阻断补体激活，排斥反应技从几分钟推迟至几天内发生，这种排斥反应被称为DXR。DXR的过程中有基因的转录及随后的蛋白质合成，产生粘附分子及细胞因子等。称为Ⅱ型内皮细胞激活。DXR的特征是移植物EC激活，受体的单核细胞及自然杀伤细胞（NK）细胞浸润到移植物内，这两种细胞的激活都与细胞因子的作用有关。

　　2.2 DXR发生机制 DXR似乎不需要XNA及补体的参与，由于再灌注及其它原因对血管内皮的损伤，微血管EC收缩，暴露出细胞下的基质成分，基持上的几种蛋白质如胶原和von willebrand因子（vWF）可以与血小板核细胞趋化蛋白3（MCP-3）和RANTES，吸引并活化单核细胞及NK细胞，单核细胞还能进一步产生TNFα、IL-1β和IFN-γ等多种细胞因子，促进激活导致血液聚及炎症发生。另外活化的血小板也可导致血栓及纤维形成。人NK不需要细胞因子或抗体的作用也可浸润到移植物内，NK细胞表面的NKG2分子可以识别EC表达与XNA结合的相同多糖成分，导致EC活化[12]。同样，人单核细胞通过特定的表面分子也可结合并激活猪的EC。虽然补体不是发生DNR的必要成分，但补体特别是C1q的参与加重DXR的程度，C1q与血小板表面的纤维蛋白原受体gpⅡb/Ⅲa结合激活血小板并使之表达P-选择素分子，促进血小板与白细胞之间的相互作用，通过单核细胞相关的组织因子（TF）导致血液凝聚[13]。总之，造成DXR发生。所谓“分子不相容性”也是发生DXR的重要原因。例如EC可产生TF凝血旁路的抑制因子，但激活的猪的EC却不能产生与人EC相类似的抑制TF的分子，从而不能对凝血过程进行有效的调控。与EC结合的IgGXNA通过Fc受体介导的移行作用使NK细胞进入移植物，发挥NK细胞的致病作用。最近研究表明与IgGXNA结合的抗原不仅是Galα1-3Gal，可能有4种不同的表位[4]。以乳糖酶消化后的猪EC与人血清作用，IgGXNA与EC结合量减少了45%-50%，而IgGXNA减少了80%，这说明与IgGXNA结合表位的多样性。另外，IgGXNA与猪EC结合要比IgG牢固，这些因素使IgGXNA的致病机制更加复杂，也使其在DXR中的作用不易被控制。

　　3 细胞介导的异种的移植排斥反应

　　只有异种移植存活期超过HAR及DXR，我们才有可能准确地描述T细胞对异种移植物的反应，这是目前T细胞在异种排斥中作用不清的重要原因。通过对不发生HAR及DXR的小鼠皮肤及胰岛异种移植实验证明[15]，T细胞针对异味种移植物及同种移植物发生的排斥反应机理相类似，只是异种移植及同种移植物发生的排斥反应强烈得多，这也是免疫抑制剂在异种移植中不好的一个原因。在体外实验，人体T细胞通过两种途径识别猪的异种抗原[16]，首先通过猪抗原呈递细胞有效地激活人细胞，使之发生直接的异种反应；另外，大量的抗原被受体的MHC-Ⅱ分子限制性T细胞所识别，导致强烈的间接异种排斥反应，在异种移植后一周内受体就可产生强烈的直接和间接异种排斥反应，在这个过程中CD+4T细胞起了很重要的作用。NK细胞缺乏的小鼠对异种移植的排斥反应速度减慢，说明了NK细胞的作用也不可忽视[17]。

　　4 延长异种移植存活时间的措施

　　4.1 去除XNA及补体 由于XNA及补体在HAR中的重要作用，去除XNA及补体能有效防止HAR的发生。选择性去除IgM可延长猪一人异种移植的生存期，方法有多种，可以用重组的含Galα-3Gal表位的糖蛋白来只附IgMXNA，也可以用抗μ链的克降抗体去除IgM[18]，这些都取得明显效果。在豚鼠一大鼠心脏移植中[19]，蛇毒植物中位生存时间（MST）达64小时，而对照组仅有15分钟。重组可溶性CD46（rSCD46,MCP）可以通过与C3a及C4b结合来抑制补体介导的损伤，达到抑制HAR的作用。有报道磺基葡萄聚糖（CMDBS25）也有抑制补体的作用。

　　4.2 转基因的动物转基因的动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。使动脉供体的血管内皮细胞表达人相应的的补体调节蛋白，达到抑制HAR的作用。人的许多补体调节蛋白在猪EC上已转染成功，这基中包括DAF（CD55）[20]，膜辅因子蛋白（MCP，CD46），同源性限制因子（HRF，CD59）[21]。用基因工程的方法阻断猪EC表达Galα-3Gal也获得成功，使H-转移酶基因在EC内表达，H-转移酶α-1，3-乳糖转移酶有相同的作用底物，相互竞争的结果使XNA识别的表位Galα-3Gal合成减少，这可能会使HAR及DXR同时受到抑制。

　　4.3 阻断内皮细胞激活 NF-kB是一种异二聚体的转录因子，在Ⅱ型反应基因激活过程中起重要作用，其中包括TF分子，粘附分子（E-选择素，ICAM-1T和VCAM-1），细胞因子（Ⅱ-1，Ⅱ-8）的基因，这些都在DXR起重要作用并与排斥反应密切相关。通常情况下NF-kB与其调节成分1kB结合存在于细胞浆中，处于失活状态[22]。但当EC激活时，1kB被磷酸酸化降解。NF-kB转移至细胞核内，上调以上免疫分子的基因活性。应用重组的腺病毒可能使EC大量表达1kB，当1kB大量表达后，即使以LPS刺激EC，在细胞核内也检测不出NF-kB，同量E-选择素的基因减少了90%。虽然体外阻断NF-kB激活可使EC活化受到抑制，是否体内也会发生类似现象并影响DXR，还需要进一步研究。

　　4.4 免疫抑制剂及其他治疗 由于异种排斥反应比同种排斥反应强烈得多，所以抑制异种排斥反应的免疫抑制剂不但作用要强，而且剂量不要大，异种移植的动物实验也证明了这一点。在仓鼠一大鼠的心脏移植中[23]应用CsA使移植物的生存时间延长一倍，其他免疫抑制剂Leflumide及Dexoxyspergualin（DSG）也取得了成功[24，25]。但是，临床实践中免疫抑制剂对抑制慢性排斥反应及延长移植物存活时间方面没有明显作用。另外对于接受大剂量免疫抑制治疗的受体来说，发生严重感染及肿瘤的可能性要高得多。但是异种移植也提供了一个对异种移植物进行特异性抑制的机会，诱导异种特异性T细胞发生耐受要比同种特异细胞容易得多，可以用猪特异性单克隆抗体封闭与T细胞发生作用的分子，使受体对移植物耐受。也可在受体异种移植前进行异源性骨髓移植，产生嵌合体，在动物实验中这已经被证实是一种有效的方法[26]。

　　虽然近几年对异种移植物的排斥反应机理有了一定程度的认识，但有很多问题仍不能回答，异种移植真正成熟地应用于临床还需进一步积累更多的资料，进行更深的实验研究。

（收稿日期 1998-10-15）

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