腺苷治疗大鼠脊髓损伤的初步研究

　　摘　要：目的　通过观察大鼠脊髓损伤后内源性细胞外腺苷含量的变化以及外源性腺苷对脊髓损伤后脊髓组织细胞外钙离子和神经功能的影响，探讨腺苷在脊髓继发性损伤中的作用。　方法　SD大鼠58只，制作成T13脊髓腹侧压迫模型，用微透析技术每20 min连续收集脊髓损伤后脊髓组织细胞外液，用高效液相色谱仪紫外检测法检测细胞外液腺苷的含量；伤前15 min蛛网膜下腔给予非特异性腺苷受体激动剂2-氯腺苷，伤后立即开始每10 min连续收集脊髓组织细胞外液，用原子吸收光谱分析法测定收集液中的钙离子浓度；于伤后24 h观察神经功能评分、倾斜平面临界角和组织学变化。　结果　脊髓损伤后腺苷浓度立即显著升高，至1 h达最高峰，且升高幅度与伤情成正比，2 h降为基础水平；大剂量2-氯腺苷蛛网膜下腔注射能显著抑制脊髓损伤后细胞外钙离子的下降，改善脊髓损伤后的神经功能。　结论　腺苷参与了脊髓继发性损伤的病理过程，其作用是保护性的。

Adenosine in treatment of rats with spinal cord injury

ZHANG Qiulin,ZHAO Jie,WANG Qiugen

　　（Department of Orthopedics, Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai 200433,China.）

　　Abstract：Objective　To observe the changes of endogenous extracellular adenosine after spinal cord injury (SCI) to rats and the effect of exogenous adenosine on extracellular calcium after SCI and post-injury neurolo-gical function.　Methods　A ventral compression injury model of T13 spinal cord was used, and the extracellular fluids were collected consecutively every 20 minutes after injury by using microdialysis. Adenosine in the samples was analyzed using high-pressure liquid chromatography (HPLC) with u.v. detection. The rats received different doses of 2-chloroadenosine (2-CADO), a nonspecific agonist of adenosine receptors, by intrathecal injection 15 minutes before injury. The extracellular fluid was collected every 10 minutes immediately after injury and the calcium was measured using atomic absorption spectrophotometer. Neurological function score, inclined plane angle, and histology were observed 24 hours after injury.　Results　A significant increase of adenosine was found immediately after spinal cord injury. The concentration of adenosine peaked at one hour after injury and dropped down to the basal level. There was a positive relation between the increase of adenosine and the severity of SCI. High dose of 2-CADO can significantly significantly inhibit the decrease of extracellular calcium and improve the neurological function of injured rats.　Conclusions　Adenosine could involve the pathological process of secondary spinal cord injury and might play a protective role in SCI.

　　Key words：Spinal cord injuries；　Adenosine；　Rats

　　腺苷(adenosine)是中枢神经系统内重要的抑制性保护递质之一，大量研究表明腺苷对脑缺血、缺氧、脑外伤有明显的保护作用［1，2］，但腺苷在脊髓损伤中的作用尚未见报道。我们采用微透析技术对大鼠腹侧压迫损伤后细胞外液腺苷含量进行了动态观察，并通过珠网膜下腔注射腺苷受体激动剂2-氯腺苷(2-CADO)观察其对脊髓损伤后脊髓细胞外钙离子和神经功能的影响，并探讨其临床意义。

　　材料与方法

　　一、大鼠腹侧压迫损伤模型制备

　　健康封闭群SD大鼠58只，体重(250±10) g，按40 mg/kg体重腹腔内注射2%戊巴比妥钠麻醉，1 h后追加1/3量维持动物处于麻醉状态。以T13为中心取背正中切口，咬去T13左侧椎弓根，暴露T13脊髓左侧作为压迫损伤侧。将自制的L形致伤钩（2.5 mm×4 mm大小）置于脊髓腹侧，通过杠杆在致伤钩的另一端挂一定的重量，使致伤钩产生垂直向上的力，持续一定时间即造成脊髓的压迫损伤。

　　二、实验动物分组

　　按致伤及处置方法的不同随机分为9组，分组情况见表1。

表1　实验动物分组情况

组　别 例　数 致 伤 及 处 置 方 法 检 测 项 目　　
A 6 　椎板开窗，不压迫 　　检测腺苷含量
B 6 　椎板开窗，压迫4 min 　　检测腺苷含量
C 6 　椎板开窗，压迫8 min 　　检测腺苷含量
D 6 　椎板开窗，不压迫 　　观察腺苷的作用
E 6 　椎板开窗，压迫8 min，蛛网膜下腔注射人工脑脊液25 μl 　　观察腺苷的作用
F 6 　椎板开窗，压迫8 min，注射低浓度2-CADO（50 μmol/L）25 μl 　　观察腺苷的作用
G 6 　椎板开窗，压迫8 min，注射高浓度2-CADO（500 μmol/L）25 μl 　　观察腺苷的作用
H 8 　椎板开窗，压迫4 min，蛛网膜下腔注射人工脑脊液（25 μl） 　　观察腺苷对细胞外钙的影响
I 8 　椎板开窗，压迫4 min，蛛网膜下腔注射2-CADO（500 μmol/L）25 μl 　　观察腺苷对细胞外钙的影响

　　三、微透析过程及腺苷的检测

　　T13～L1右侧椎间孔给以扩大开窗，在T13脊髓右侧正中偏后方，水平向头侧与脊髓纵轴矢状面成45°角插入微透析探针（MD-2200型，膜长2 mm，直径0.5 mm，美国BAS公司产品），使透析膜完全在脊髓实质内，外套管保护后用牙托基质固定于脊柱及肋骨上。微量注射泵以2 μl/min的速度向探针内灌注人工脑脊液，平衡2 h，以排除探针穿刺造成的影响。每次用探针前先测其回收率，将其后收集的样品测得值除以回收率就得到细胞外液中的实际浓度。样品收集由计算机控制收集温度为4 ℃，收集时间为20 min。损伤前收集1管作为基础对照管，损伤后分别在20、40、60、80、100和120 min连续收集6管，收集后置-70 ℃冰箱保存待测。

　　取20 μl透析液样品，用HPLC紫外检测法，流动相采用10 mM NH4H2PO4∶CH3OH(90∶10)，pH=4.8，流速1 ml/min，检测波长为254 nm，灵敏度0.01 AUFS，外标法峰面积定量。标准腺苷浓度分别用0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00μM测定标准曲线，得到回归方程：S=848.8847+2780.9710C，r=0.9992。按回归方程即可求出样品的腺苷浓度。

　　四、蛛网下腔插管及观察指标

　　健康封闭群SD雄性大鼠24只，体重(250±10) g，2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，按Yaksh方法将外径为0.61 mm的PE-10聚乙烯管缓慢插入蛛网膜下腔，深度约达T13水平上缘，外露约0.8 cm，缝合切口并固定插管。观察24 h确认无医源性损伤后，分成上述D、E、F、G组。各组所有动物均于伤后24 h观察以下指标：(1)神经功能评分按改良的Gale标准：0分：双后肢肌力为零，感觉丧失；1分：有感觉存在，对针刺有保护反应，但无自主运动；2分：双后肢有轻微运动，但无功能，不能负重；3分：双后肢有明显运动，但是不能负重；4分：能负重行走数步，但是不稳定，不能持久；5分：能缓慢行走，不灵活，存在一定的缺陷；6分：可正常行走。(2)斜板试验：采用Rivlin的方法测定斜面临界角度，由未知实验细节者进行。(3)病理学检查：采用心内灌注生理盐水、10%中性福尔马林的方法处死动物，取出伤段脊髓置于10%中性福尔马林中固定，经脱水、石蜡包埋后，连续切片，层厚5μm，中间部分切片分别行普通HE染色和Olszwski尼氏小体染色，普通光学显微镜下检查。

　　五、细胞外液收集及钙离子(Ca2+)检测

　　同上方法珠网膜下腔插管后观察24 h，筛选无医源性损伤大鼠16只按上述分组，同上方法插入微透析探针，微量注射泵以2 μl/min的速度通过PE-50管向探针内灌注不含Ca2+的人工脑脊液，平衡1.5 h后开始收集。计算机设置10 min收集1管。各组均于伤前收集10 min，然后从珠网膜下腔给药，15 min后致伤，致伤量为34.5 g压迫4 min，收集伤后10、20、30、40、50和60 min 微透析液共7管，每次微透析前测探针的回收率，收集液用去离子水稀释后，通过日立I-8000型偏振塞曼原子分光光度计，采用原子吸收火焰光谱分析法测定溶液中的离子浓度(μg/ml)，然后根据稀释的倍数计算离子含量，换算成摩尔浓度，再除以回收率即得到细胞外实际的Ca2+浓度。

　　六、统计学处理

　　数据以均数±标准差表示(±s)，采用Student′s t检验进行统计分析。

　　结果

　　一、脊髓损伤后细胞外腺苷含量的变化

　　微透析探针在本实验条件下，测得腺苷的回收率为(10.9±0.5)%。表2为脊髓损伤后各时段细胞外液中的实际腺苷浓度。

表2　大鼠T13伤段脊髓细胞外液腺苷含量的变化(n=6,μmol/L)

时间（min） A组 B组 C组
损伤前 4.38±0.43 4.41±0.37
 4.36±0.42
 
损伤后 　
　0～20 4.39±0.40 5.02±0.60* 6.98±0.73△
　20～40 4.41±0.41 5.13±0.71* 7.24±0.89△
　40～60 4.44±0.36 6.47±0.70** 9.12±1.08△
　60～80 4.43±0.38 5.21±0.63* 6.74±0.93△
　80～100 4.41±0.40 4.70±0.57 5.23±0.81*
　100～120 4.42±0.37 4.39±0.42 4.51±0.54

　　注：*P＜0.05；**P＜0.01与A组比较,△P＜0.01与B组比较

　　 从表2中可以看出，假手术组（A组）细胞外腺苷浓度无明显变化，而脊髓损伤两组伤段脊髓组织细胞外腺苷浓度伤后均立即升高，至1 h升至最高峰，压迫8 min组（C组）变化规律与压迫4 min组（B组）基本相同，但升高幅度更大，与压迫4 min组相比，在伤后80 min前有极显著差异(P＜0. 01)。两种不同程度损伤均于100 min后恢复至伤前水平。

　　二、2-CADO对脊髓损伤后神经功能的影响

　　脊髓损伤后24 h各实验组及对照组神经功能评分及斜板试验临界角度如表3所示。

表3　2-CADO对脊髓损伤后神经功能的影响

组 别 例数 神经功能评分 倾斜平面临界角(度)
D 6 6 74.5±1.5
 
E 6 0.67±0.23 31.3±2.8
F 6 0.83±0.33 33.6±3.9
G 6 　　2.83±0.51*△ 46.2±3.1*△

　　注：与E组比较,*P＜0.01；与F组比较,△P＜0.01

　　 低浓度2-CADO治疗组（F组）虽然较对照组（E组）神经功能评分及倾斜平面临界角有所提高，但无统计学意义，而高浓度2-CADO治疗组（G组）较对照组的神经功能评分及倾斜平面临界角均有显著的改善(P＜0.01)，与低浓度2-CADO治疗组相比也有显著性差异(P＜0.01) 。

　　三、组织学检查

　　重度损伤对照组伤后24 h，伤段脊髓切片HE 染色镜下可见脊髓组织结构严重破坏，中央管破裂，灰质中可见片状出血，神经元几乎全部坏死消失，仅脊髓背角存在几个神经元，且尼氏体稀少。白质中可见胶质细胞肿胀、空泡形成，髓鞘水肿、断裂，结构排列严重紊乱，Olszwski染色几乎未见任何尼氏小体阳性染色。低浓度2-CADO组镜下也未见明显改善，仍未见神经元存活。高浓度2-CADO组镜下可见有少量神经元存活，但神经元内尼氏小体非常少，灰质内出血仍较明显，但白质的变性坏死情况较未治疗组明显改善，胶质细胞和髓鞘肿胀明显减轻，排列结构仍较紊乱，但完整性、连续性比对照组明显好转。

　　四、脊髓细胞外钙浓度

　　本实验条件下测得损伤前脊髓细胞外钙浓度为：(826.3±39.2) μmol/L，损伤后10 min内迅速下降为(42.5±12.3) μmol/L，以后逐渐恢复，至1 h已恢复至伤前的40%左右，至2 h已基本恢复正常。而2-CADO治疗组使细胞外钙的浓度明显稳定，与对照组相应时段相比，均有极显著改善(P＜0.01)，但2-CADO不能完全阻止细胞外钙的下降(表4)。

表4　大鼠脊髓损伤后伤段脊髓细胞外钙浓度的变化（μmol/L）

项　目(min) H　组 I　组
　损伤前 826.3±39.2
 833.2±41.1
 
　损伤后 　
　　0～10 42.5±12.3 207.8±88.5*
　　10～20 117.2±24.5 226.2±23.5*
　　20～30 192.3±27.2 271.7±28.2*
　　30～40 261.7±26.5 329.8±30.1*
　　40～50 312.6±28.0 381.3±34.5*
　　50～60 340.1±36.3 431.2±41.1*
　　110～120 803.9±43.1 820.1±46.3

　　注：与对照组对应时段比较，*P＜0.01

　　讨论

　　一、腺苷的生化代谢及微透析的原理

　　无论细胞内或细胞外的ATP都可以经过ADP、AMP转化为腺苷。AMP经5′- 核苷酸酶催化形成腺苷，细胞外的腺苷被细胞摄取后经腺苷激酶催化又可形成AMP，再进一步转变为ATP。腺苷经腺苷脱氨酶(ADA)降解为肌苷，后者再经核苷酶形成次黄嘌呤。研究表明［3］，细胞外的腺苷50%被细胞摄取，25%被降解为肌苷。由于存在着如此高效的失活机制，因而细胞外的腺苷浓度很低。传统的组织匀浆方法往往已将腺苷破坏降解，因而不易检测到。微透析是利用半透膜将组织间液物质滤出的过程，组织间液中的腺苷及其他低分子物质(如Ca2+等)顺着浓度梯度迅速弥散到探针内的人工脑脊液中，而大分子的酶则不能透过透析膜，因而腺苷不被降解，而易于检测。因此微透析技术无疑是检测细胞外腺苷以及其他神经递质最好的方法。国外学者在20世纪80年代首先将微透析技术应用于脑神经递质的检测，但用于脊髓中的神经递质以及Ca2+检测尚未见报道。

　　二、脊髓损伤后腺苷升高的意义

　　本实验通过对大鼠脊髓损伤后伤段脊髓细胞外液腺苷含量的检测发现，脊髓损伤后，腺苷含量立即升高，至1 h升至高峰，且与损伤程度呈正相关。 然后于伤后2 h左右降为正常值。研究表明：过量的兴奋氨基酸（EAA）、高K+以及神经系统缺血、缺氧均可使内源性腺苷浓度增高［1，4，5］。大量的实验证明脊髓损伤早期兴奋性氨基酸（如谷氨酸、门冬氨酸）以及血管活性物质（如儿茶酚胺等）含量显著增高［6，7］，因此脊髓损伤后EAA的升高、脊髓缺血缺氧以及损伤细胞释放K+等，可能是脊髓损伤后腺苷浓度升高的主要原因。本研究结果表明，内源性腺苷参与了脊髓继发性损伤的病理过程，脊髓损伤后腺苷出现显著升高且与伤情呈正比，可能是损伤后神经系统自我保护的一种表现。

　　三、腺苷在脊髓损伤中的作用及其可能机制

　　腺苷是中枢神经系统内主要的抑制性调节因子之一，腺苷及其类似物用于治疗脑缺血、缺氧以及脑外伤已有大量的报道，而且一致认为腺苷对脑缺血缺氧和脑外伤有明显的保护作用［1，2］。但腺苷在脊髓损伤中的作用尚未见任何报道。本研究首次将腺苷用于脊髓损伤的治疗，结果显示腺苷从中枢给药能显著减轻脊髓损伤的病理损害，改善神经功能，而且有着明显的剂量依赖性，但不能完全改善神经功能。本研究结果表明外源性腺苷对脊髓损伤具有明显的保护作用，其具体的保护机理尚不清楚。

　　近年来大量的研究表明，除脊髓原发损伤外，脊髓的继发性损伤是导致脊髓不可逆损害的主要原因，已发现许多因素参与了脊髓的继发性损害。其中钙超载已被认为是导致细胞死亡的“最后共同通道”［8］。脊髓损伤(SCI)后细胞内Ca2+超载也被认为是造成脊髓继发性损伤的主要病理机制之一［9，10］。因而运用钙离子拮抗剂治疗脊髓损伤已被广泛运用于实验研究和临床［11］。本实验观察到损伤早期细胞外钙急剧下降，也间接地说明损伤早期存在大量的钙离子内流。本实验结果显示随着时间的推移，由于血浆钙及邻近组织钙的补充使细胞外钙又逐步恢复正常，但这并不说明钙内流的停止。许多学者发现SCI后伤段脊髓总钙是明显增加的，且持续48 h以上，这足以证明这一点［9，10］。本实验观察到，腺苷受体激动剂2-氯腺苷能明显抑制脊髓损伤早期Ca2+内流，阻止细胞外钙的降低，结果表明， 2-CADO可能通过抑制部分Ca2+的内流，阻止了Ca2+超载引起的恶性循环，从而起到神经保护作用。其机理可能在于：(1)2-CADO通过A1受体突触前抑制兴奋性递质（包括兴奋性氨基酸）等的释放，从而抑制受体门控的钙内流［4，12-14］；(2)2-CADO通过A1受体突触后抑制细胞的兴奋性从而抑制电压门控的Ca2+内流［14］；(3)2-CADO通过A2受体作用增加糖原解，增加ATP的形成，同时扩张血管增加血流量使细胞能量供应增加，从而维持钙泵的功能［15，16］。

　　腺苷的生理作用是多方面的，腺苷对脊髓损伤保护机理可能也是多方面的。本实验结果表明其保护机理至少与抑制Ca2+内流从而抑制Ca2+超载以及Ca2+依赖的EAA的释放等有关，但确切机制尚待进一步研究。

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