糖皮质激素诱导性股骨头坏死模型的血管改变

　　摘　要：目的　探讨在糖皮质激素诱导股骨头坏死过程中血管形态的改变与髓腔内脂肪填塞的关系。　方法　12～18个月龄的健康日本大耳白兔52只，按2.5 mg。kg-1。d-1注射地塞米松建立股骨头坏死模型，通过血管铸型扫描电镜观察、墨汁灌注切片光镜观察及图像分析等方法观察用药中和停药后股骨头病理和血管形态的变化。　结果　用药2周出现股骨头髓腔内脂肪填塞,窦状隙血管因脂肪细胞压迫变细，血管铸型、墨汁灌注切片显示了血管表面压迹。病变随用药时间的延长而加重，窦状隙血管逐渐失去其结构特征。图像分析示股骨头内血管面积进行性下降，8周约为对照组的1/4。停药6周负重区髓腔内仍存在明显脂肪化,血管纤细、稀少。实验4周，股骨头内出现典型骨坏死灶。随时间的延长，坏死灶增大、股骨头坏死程度加重。　结论　髓腔内脂肪填塞是导致糖皮质激素诱导性股骨头坏死中缺血损害的重要病理因素之一,尤其在股骨头坏死的早期起着非常重要的作用。

Changes of blood vessels in glucocorticoid-induced avascular necrosis of femoral head in rabbits

ZHOU Qiang,LI Qihong,YANG Liu

　　（Department of Orthopaedics,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038, China.）

　　Abstract：Objective　To evaluate the effects of fatty tamponade in medullary cavity (serious intramedullary fatty infiltration) on the changes of blood vessels in femoral heads during the pathological process of glucocorticoid(GC)-induced avascular necrosis (AVM) of the femoral heads.　Methods　The animal model of AVN was established with injection of dexamethasone(DEX) at a high dose of 2.5 mg。kg-1。d-1 in rabbits. Histopathological and morphological changes of blood vessels in the femoral heads were investigated during GC-treatment and after the cessation scanning electron microscope, light microscope, and image analysis.　Results　At the 2nd week of DEX-treatment, the fatty tamponade in the medullary cavity appeared in the femoral heads. Intramedullary vascular sinusoids were pressed by an excess of lipocytes and became narrow.The impressions of lipocytes on the surface of vascular sinusoids were definitely displayed on the vascular casts and ink-perfused slides of the femoral heads. These changes were pronounced with the prolongation of the treatment and the vascular sinusoids gradually lost their characteristics.Image analysis showed that the vascular area in the femoral heads continuously decreased.At the 8th week, the effects of fatty tamponade were the most marked. Intramedullary vessels became very sparse and the vascular area decreased to 1/4 of the controls. At the 6th week after the GC-treatment cessation, intramedullary fatty infiltration still existed. The blood vessels were fine and sparse, and the structural features of vascular sinusoids disappeared in the load-bearing regions of the femoral heads. At the 4th week, typical osteonecrosis focuses appeared in the femoral heads. The focuses became larger and the degree of osteonecrosis was increasing with the time of experiment.　Conclusion　The fatty tamponade in the medullary cavity is one of the important pathological factors causing ischemic damage to the femoral heads, and plays an important role in the early stage of GC-induced AVN.

　　Key words：Femur head necrosis；　Microcirculation；　Glucocorticoids

　　近年来的研究表明，糖皮质激素(glucocorticoid,GC)的应用已成为股骨头坏死（avascular necrosis of femoral head，AVN）的主要病因之一，但其发病机制尚不清楚［1，2］。多数学者认为血循环障碍是其主要原因。我们采用GC诱导性AVN动物模型，通过观察用GC过程中和停药后股骨头内组织病理和循环形态学的变化，初步探讨了髓腔内脂肪填塞(即骨髓的严重脂肪化)在GC诱导性AVN病理发展过程中的作用。

　　材料与方法

　　一、动物分组及模型制作

　　12～18个月的健康日本大耳白兔52只（第三军医大学实验动物中心提供），体重为3.5～4.5 kg。随机分为2组：实验组(n=42)：每天1次肌注2.5 mg/kg地塞米松(Dexamethasone,DEX),至第8周末停药,在2、4、6、8、10、14周分批处死；对照组(n=10)：肌注等量生理盐水，分别在第8、14周处死。2组动物均给予抗生素预防感染。

　　二、检测指标

　　1．体态观察:观察各组动物实验过程中体态变化。

　　2．墨汁灌注标本的制备、观察及图像分析：动物麻醉并全身肝素化后,行腹主动脉、腹腔静脉插管,在生理动脉压下生理盐水持续冲洗血管床约20 min,用2.5%戊二醛固定血管床后，以相同的压力经过滤器连续灌注10%福尔马林复合墨汁,结扎灌注血管,将其整体浸于10%的福尔马林中固定。解剖双侧股骨，经脱钙、漂白、脱水、透明等处理后, 分别行股骨头的常规石蜡切片HE染色及约250 μm的纵向、横向厚切片,光镜观察和股骨头骺部窦状隙血管区图像分析。

　　3．骨内血管铸型标本的制备与观察：动物血管床的冲洗和固定同前。取适量预聚合状态的血管铸型剂,经腹主动脉插管注入,至腹腔静脉回流出连续的铸型剂为止。结扎灌注血管。室温放置，待铸型剂完成聚合反应后,解剖双侧股骨,脱钙后强碱腐蚀、缓慢流水冲洗，自然干燥，即得血管铸型标本。大体观察后，于股骨头软骨下区取样扫描电镜观察。

　　4．组织病理学观察：2组动物按时相点分批处死,切取双侧股骨头用10%中性福尔马林缓冲液固定, 连同墨汁灌注标本一起，作常规切片HE染色，光镜观察。计算股骨头软骨下区平均骨陷窝空虚率（%），以表示骨组织坏死程度。

　　三、统计学处理

　　实验所得数据以均数±标准差(±s)表示,采用第三军医大学数学教研室SPMR医用统计程序包进行单因素方差分析。

　　结　　果

　　一、动物体态的变化

　　实验组动物用药第2周开始出现消瘦、大腹、粗颈、四肢细瘦等，类似柯兴氏征，并随用药时间的延长而加重。停用DEX 2周后开始明显恢复。

　　二、组织病理学变化

　　1．实验组：用DEX 2周时，髓腔内骨髓细胞极少，充满了大量的脂肪细胞，大小不一，排列紧密，其间的窦状隙血管受压变细。用DEX 4周和6周时，出现典型的骨坏死灶（图1），髓腔脂肪填塞严重,窦状隙血管稀少,临软骨下骨板的血管明显淤血扩张见。用DEX 8周时，骨坏死灶增大，骨髓的病变特征为大片灶性或弥漫性骨髓坏死、溶解、渗出，髓内小血管变性、坏死（图2）；非坏死区骨髓基本为脂肪细胞所取代，窦状隙血管少见。停用DEX 2周时，髓腔内骨髓细胞增多、脂肪萎缩,表现为大部分脂肪细胞的皱缩、死亡，相临窦状隙血管不规则扩张，并充满红细胞，在关节面下方可见血管仍淤血扩张,其周围有因长期淤血形成的纤维网状结构。停用DEX 6周时，骨坏死程度更严重，负重区髓腔内仍存在明显的脂肪化，窦状隙血管稀少，相应的软骨下方仍可见淤血扩张的血管；非负重区髓腔内窦状隙血管逐渐再生、形态特征部分恢复，骨髓细胞增多。

　　2．对照组：两时相间无明显区别，未见病理变化。

　　2．图像分析：用DEX后，股骨头骺部血管面积(以血管面积与统计场面积比表示)进行性下降，实验组各时相点分别为：用DEX后第2周0.602±0.053、第4周0.540±0.120、第6周0.308±0.063、第8周0.180±0.024，停用DEX后第2周0.393±0.085、第6周0.201±0.041；对照组为0.729±0.056。统计结果显示，实验组各时相点均明显低于对照组，分别与对照组相比，差异均有极显著性意义(P＜0.01)，其中以用DEX后第8周最低，约为对照组的1/4。

　　四、股骨头血管铸型的观察

　　1．大体标本观察：实验组随着用DEX时间的延长，血管密度呈进行性减低，以股骨头负重区变化最为明显，严重者出现血管铸型塌陷而不能保持股骨头外形。在停药6周，股骨头负重区血管密度仍很低，非负重区血管密度则有明显恢复。

　　2．扫描电镜观察：(1)对照组窦状隙血管粗大、管经均匀，无压迹。(2)实验组：用DEX 4周，窦状隙基本结构尚存在，但管径粗细不均,有显著的压迹（图6）；用DEX 6、8周，窦状隙结构紊乱，血管变得纤细或被阻断,并逐渐失去窦状隙的结构特征；停用DEX 2周，大部分窦状隙血管不规则扩张，而部分仍处于受压状态，窦状隙结构极不规则（图7）；停DEX 6周，血管少，其中部分血管极细，失去窦状隙血管结构特征，以负重区明显，非负重区的一些血管逐渐再生，部分恢复窦状隙结构特征（图8）。

图6　用DEX4周，窦状隙血管粗细不均，血管表面有明显压迹（粗箭头），SEM×300

图7　停用DEX2周，窦状隙血管不规则扩张（粗箭头）和受压（↑）并存　SEM×500

图8　停用DEX6周，部分窦状隙血管逐渐再生，结构特征部分恢复（粗箭头）SEM×200

　　讨　　论

　　GC导致AVN的病理机制已成为近年来国内外学者研究的焦点之一。临床和实验病理观察均发现髓腔内脂肪填塞是GC诱导的坏死股骨头内共同的病理变化特点。于是，有的学者提出了骨内高压进行性缺血学说，即脂肪细胞的增多和增大使髓内压升高，血流灌注下降，从而引起股骨头缺血，并行成恶性循环，导致AVN［3-5］。但另有些学者对其实验证据提出置疑，认为骨内压升高可能是骨坏死病理变化过程中继发或伴随的现象［1,6,7］。因此，对髓腔内脂肪填塞、骨内压升高在骨坏死病理过程中所起的作用及其机制的研究是十分必要的。

　　本实验结果显示，股骨头髓腔内脂肪填塞在用DEX第2周即出现，在时间上先于出现典型骨坏死灶2周，并随用药时间延长而呈进行性加重，压迫窦状隙血管。近年来有研究表明，GC可以使骨髓基质细胞和正处于分化阶段的各种细胞向脂肪细胞转化［8］。骨内血管铸型和墨汁灌注切片的观察分别从三维和二维结构上清楚地显示了用GC过程中骨髓腔内增多增大的脂肪细胞压迫窦状隙血管，随着用药时间的延长而加重，甚至使其完全阻断。同时，软骨下骨板内的血管及其下的髓内血管因回流受阻而明显扩张,组织学切片显示扩张的血管内血液淤滞,其周围因长时间淤血而形成了典型的网状纤维结构。股骨头骺部髓内血管面积进行性减少，至第8周降为约正常的1/4。它和股骨头逐渐严重的髓腔内脂肪填塞与股骨头坏死灶不断扩大和骨坏死程度不断加重的形态学表现相一致。窦状隙血管的严重受压可以引起股骨头的血流受阻和血流量下降。因此，髓腔内严重的脂肪填塞可能是股骨头早期缺血的直接原因。

　　关于停用GC后股骨头的病理变化过程的研究较少。本实验观察发现，停药2周骨髓内大部分脂肪细胞皱缩、死亡，与同时发生的异位沉积脂肪明显减少的动物体形变化相一致，是停药后髓内异常沉积的脂肪组织失去GC支持而萎缩的结果。在血管铸型和墨汁灌注切片上大部分窦状隙血管不规则扩张，血管面积部分恢复，是由于脂肪细胞的萎缩、死亡解除了对窦状隙血管的压迫。停药6周，负重区髓腔内仍存在严重的脂肪化，与股骨头内骨坏死病变好发部位相吻合。这一病理变化也与股骨头骺部血管的形态特点基本相一致。在严重脂肪化的股骨头负重区，血管纤细而稀少，而临关节面的血管仍存在明显扩张，且此时相骺部血管面积极低,与用DEX 8周无显著差别。这些结果提示，髓腔脂肪填塞导致的股头缺血可能继续存在。此外，一些区域的血管减少也可能与骨髓坏死有关。

　　关于停药后6周负重区髓腔内为何仍存在严重的脂肪化，本实验尚不能得出满意的结论。是否由于脂肪细胞对突然停药的反应已消失，而GC治疗引起的脂肪代谢紊乱(如高血脂症等)仍持续存在(血脂在停药6周才恢复正常)以及一直存在的慢性缺血缺氧等共同作用的结果，还有待于进一步研究。

　　近年来的临床和实验研究表明，GC诱导性AVN可能是多种病理因素协同作用的结果，如GC治疗导致的高脂血症、血管的脂肪栓塞、股骨头供血动脉的病变等。髓腔内脂肪填塞导致股骨头因血流受阻而缺血，是引起AVN的重要病理因素之一，尤其在AVN的早期起着非常重要的作用。

　　基金项目：重庆市应用基础研究项目(193)

　　参考文献：

　　［1］Arlet J.Nontraumatic avascular necrosis of the femoral head:past, present and future.Clin Orthop,1992,(277):12-21.

　　［2］Mont MA, Hungerford DS, Maryland B.Current concepts review:non-traumatic avascular necrosis of the femoral head.J Bone Joint Surg(Am),1995,77:459-474.

　　［3］Hungerford DS,Lennox DW.The importance of increased intraosseous pressure in the development of osteonecrosis of the femoral head:implications for treatment. Orthop Clin North Am,1985,16:635-654.

　　［4］Wang GJ,Sweet DE,Reger SI,et al.Fat-cell changes as a mechanism of avascular necrosis of the femoral head in cortisone-treated rabbits.J Bone Joint Surg(Am),1977,59:729-735.

　　［5］Solomon L.Mechanisms of idiopathic osteonecrosis.Orthop Clin North Am,1985,16:655-667.

　　［6］Jones JP Jr.Fat embolism and osteonecrosis.Orthop Clin North Am,1985,16:595-633.

　　［7］Warner JJP,Philip JH,Brodsky GL,et al.Studies of nontraumatic osteonecrosis, manometirc and histologic studies of the femoral head after chronic steroid treatment:an experimental study in rabbits.Clin Orthop,1987,(225):128-140.

　　［8］Lockin RM,Williamson MC,Beresford JN，et al.In vitro effects of growth factors and dexamethasone on rat marrow stromal cells. Clin Orthop, 1995,(313):27-35.