迷走神经刺激对红藻氨酸致癫痫大鼠孤束核内谷氨酸受体和γ-氨基丁酸受体的影响

　　【摘要】　目的　探讨红藻氨酸（KA）致癫痫和迷走神经刺激抗癫痫的作用机制。方法　把动物分为KA组、迷走神经刺激+KA组和对照组。每只大鼠的延髓尾段切片分为5套。第1、2套切片分别入兔抗GluR5或小鼠抗GABAAR血清，用ABC法进行免疫组化染色，观察孤束核内GluR5和GABAAR阳性结构的变化；第3～5套切片分别用于替代对照或Nissl染色。结果　（1）对照组动物的孤束核内可见中等密度的GluR5样和GABAA受体β亚单位（GABAARβ）阳性神经元、神经纤维和末梢；（2）KA组动物孤束核内GluR5阳性结构的密度增加，而GABAARβ阳性结构的密度降低；（3）迷走神经刺激（VNS）+KA组动物孤束核内的GluR5和GABAARβ阳性结构的密度变化与KA组相反，即GluR5阳性结构减少和GABAARβ阳性结构增加。结论　孤束核内的谷氨酸受体和GABAA受体在KA致癫痫和VNS抗癫痫过程中可能发挥着重要的作用。

Influence of vagus nerve stimulation upon glutamate receptor and GABAA receptor in nucleus tract solitary of the kainate induced epileptic rat

WANG Xin　ZHANG Yan

　　Department of Neurology, Zhongshan Hospital,Shanghai Medical University, Shanghai 200032， China

　　【Abstract】　Objective　To clarify the influence of vagus nerve stimulation (VNS) upon glutamate receptor (GluR) and GABAA receptor positive structures in the nucleus tract solitary (NTS) of the kainate (KA) induced epileptic rat.Methods　All rats were divided into KA group, vagus nerve stimulation+KA group and the control group. The sections of the caudel medullary oblongata from each rat of every group were collected into 5 sets. The first and second sets of the sections were used to process for immunohistochemical staining by using specific rabbit and mouse antibodies against GluR5 and GABAAR and to observe the changes of GluR5 and GABAAR positive structures in the NTS. The third to fifth sets of the sections were used for control tests and Nissl′s staining.Results　(1) In control group, medium density of GluR5-like immunoreactive (GluR5-LI) and GABAA receptor β chain (GABAARβ)-LI neuronal cell bodies, fibers and terminals were observed in the NTS; (2) In KA group, the density of GluR5-LI positive structures were increased, while the density of GABAARβ-LI positive structures were decreased; (3) In VNS+KA group, the changes were contrary to the KA group, showing, the density of GluR5-LI positive structures were decreased, and the density of GABAARβ-LI positive structures increased.Conclusion　 Glutamate and GABAA receptors in NTS might play important roles in KA induced epilepsy and in anti-epileptic effects of VNS.

　　【Key words】　Epilepsy; Receptors, glutamate; Receptor, GABAA; Vagus nerve; Kainic acid

　　近年来，迷走神经刺激(vagus nerve stimulation，VNS)作为一种非药物抗癫痫治疗方法倍受关注，大量的动物实验及临床结果已证实,VNS具有明确的抗癫痫效果［1,2］,但其机制尚不清楚。有学者观察到，孤束核等结构与VNS的抗癫痫作用有关［3］；还有学者观察到，VNS可使红藻氨酸(kainate，KA)致癫痫大鼠海马和齿状回内N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）受体1亚型阳性细胞数量减少［4］。孤束核是迷走神经进入中枢后的终止部位，但VNS对孤束核内谷氨酸受体（GluR）和γ-氨基丁酸（GABA）受体的影响尚未见报道。为了阐明KA致癫痫和VNS抗癫痫的作用机制，我们采用免疫组织化学染色技术，观察了VNS对KA致癫痫大鼠孤束核内GluR5和GABAA受体免疫组化反应阳性结构的影响，进一步探讨KA致癫痫和VNS抗癫痫的作用机制及其与GluR和GABA受体的关系。

　　材料和方法

　　1. 动物：实验用雄性SD大鼠24只，体重190～250 g，将动物随机分成KA组、 VNS+KA组和对照组,每组8只鼠。

　　2. KA组鼠的处理：腹腔注射KA(8 mg/kg)制成癫痫发作模型，癫痫模型的成功与否以其发作时的行为变化为主要指征。

　　3. VNS+KA组鼠的处理：将乌拉坦(800 mg/kg)经腹腔注射麻醉大鼠，手术分离颈左侧迷走神经，连接刺激电极。待大鼠清醒后，行迷走神经刺激。刺激参数：输出电流1.5 mA,频率30 Hz，波宽0.5 ms，刺激时间30 s，间隔5 min。然后，按KA组方法制备癫痫模型鼠，再继续进行VNS，重复10次，观察其行为变化。

　　4. 对照组动物的处理：腹腔注射与KA液等量的生理盐水，手术分离出颈部左侧迷走神经，但不对其进行刺激。

　　5. 取材：（1）KA组：癫痫模型制成后，观察2 h，记录癫痫发作次数。戊巴比妥钠腹腔注射麻醉下开胸，经左心室插管，先用0.9%生理盐水冲洗血液，再用含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH7.3)灌注固定。灌注完毕立即取脑并置入上述新鲜固定液中后固定4～6 h，再移入含30%蔗糖的PB中至沉底(4℃)。（2）VNS+KA组：待癫痫模型鼠发作次数减少≥50%后取材，方法同上。（3）对照组：与VNS组取材时间相当，方法同上。

　　6. 免疫组化染色：冰冻横切延髓尾段，片厚30 μm，切片隔4张取1张，分5套收集。按ABC法进行免疫组化染色，每套切片孵育抗体量均为0.5 ml。(1)第1、2套切片分别入兔抗GluR5(UBI)和小鼠抗GABAA受体β亚单位(GABAARβ)血清，孵育24 h；(2)切片分别入Biotin标记的驴抗兔IgG(Chemicon)或Biotin标记的驴抗小鼠IgG(Jackson)，孵育4 h；(3)切片均放入Avidin-HRP复合物(Vector)中孵育2 h；(4)放入含二甲基联苯胺(DAB)8 mg和0.001%的H2O2的0.05 mol/L trisHCl缓冲液40 ml中呈色。第1抗体和第2抗体的浓度为1 mg/L和10 mg/L，Avidin-HRP复合物的浓度均为5 mg/L，抗体和复合物的稀释均用含2%正常马血清和0.3%Triton×100的0.01 mol/L PBS。上述孵育均在室温下进行，各步骤之间均用PBS清洗切片。对照实验用正常兔血清或正常小鼠血清代替第1抗体孵育第3、4套切片，其余的染色步骤同上。第5套切片用Nissl染色,以便对照观察和定位免疫组化染色的阳性结果。

　　7. 结果分析和统计学处理：各组动物中，每只大鼠均随机选取6张切片，在明视野下计数双侧孤束核内GluR5和GABAARβ阳性神经元的数量。高密度：≥10个/100 μm2；中等密度：6～9个/100 μm2；低密度：≤5个/100 μm2。对上述各组的计数结果进行配对t检验。

　　结果

　　1. 行为变化：KA组给药后平均3 min出现肢体抽搐、跌到及强直-阵挛性抽搐，呈重型发作。VNS+KA组平均 5 min出现行为变化，表现为须动和头面部抽搐，呈轻型发作。

　　2. 免疫组化结果：在孤束核的全长均可观察到GluR5和GABAARβ阳性神经元、神经纤维和末梢。GluR5和GABAARβ阳性反应产物不仅位于胞体和突起的膜上，而且位于胞质内；阳性纤维具有粗细均匀、行径较直、膨体较丰富等特点；阳性末梢多呈点状(图1～6)。

　　在对照组动物的孤束核内可见中等密度［（7.2±0.7)个/100 μm2］的GluR5和中等密度［(8.2±0.4)个/100 μm2］GABAARβ阳性神经元(图1、4)。GluR5和GABAARβ阳性神经元多为中等大小（直径为20～35 μm），呈梭形、三角形和圆形。GABAARβ阳性神经元的突起较长，小的（≤19 μm）和大的（≥36 μm）的GluR5和GABAARβ阳性神经元较少见。GluR5和GABAARβ阳性纤维和末梢较稀疏（图1、4）。KA组动物孤束核内可见高密度［（15.3±1.1)个/100 μm2］的GluR5阳性神经元，阳性神经元的染色明显变深，GluR5样阳性纤维和末梢的密度增加（图2）。而GABAARβ阳性神经元的数量减少［（4.2±0.4)个/100 μm2］，阳性神经元的染色明显变浅，神经纤维和末梢的密度明显降低(图5)。KA组与对照组动物孤束核内的GluR5阳性神经元、神经纤维和末梢的密度比较，差异有显著意义（P＜0.01）；GABAARβ阳性神经元、神经纤维和末梢的密度比较，差异也有显著意义（P＜0.05）。见表1。

　　VNS+KA组动物孤束核内GluR5和GABAARβ阳性结构的密度变化与KA组相反，即GluR5阳性神经元的数量明显减少［（6.3±0.7)个/100 μm2］，基本上恢复到正常水平，但染色变淡（图3）；GABAARβ阳性神经元增加［（9.3±0.4)个/100 μm2］，也基本上恢复到正常水平，但染色变深（图6）；GluR5和GABAARβ阳性纤维和末梢的密度也发生与阳性神经元相类似的变化(图3、6)。VNS+KA组与KA组的GluR5阳性结构的密度和GABAARβ阳性结构的密度比较，差异均有显著意义（P＜0.01，P＜0.05）；VNS+KA组与对照组的GluR5和GABAARβ阳性结构的密度比较，差异无显著意义（P＞0.05）。见表1。

表1　大鼠孤束核内谷氨酸受体和

　　γ-氨基丁酸A受体的密度(±s，个/μm2)

动物分组 鼠数 谷氨酸受体5 γ-氨基丁酸A受体
NC组 8 7.2±0.7
 8.2±0.4
 
KA组 8 15.3±1.1** 4.2±0.4*
VNS+KA组 8 6.3±0.7△△ 9.3±0.4△

　　注：NC：对照组；KA：红藻氨酸；VNS：迷走神经刺激； 与NC组比较，*P＜0.05　**P＜0.01； 与KA组比较，　△ P＜0.05　△△ P＜0.01　　GluR5和GABAARβ阳性结构的上述密度变化主要见于孤束核的中、尾段，而各组动物双侧阳性神经元计数无明显差异（P＞0.05）的孤束核吻段，其GluR5和GABAARβ阳性结构密度亦无明显变化。另外，在与孤束核紧邻的迷走神经运动核内，也可见到GluR5和GABAARβ阳性神经元，各组动物迷走神经运动核内的GluR5和GABAARβ阳性神经元的数量也几乎不发生变化。

　　用正常兔血清或正常小鼠血清代替第1抗体孵育切片的对照实验结果均为阴性。

　　讨论

　　中枢神经系统内的氨基酸类物质是独具特色的神经递质，以其对突触后神经元的兴奋性或抑制性作用又可分为两类，两者分别以谷氨酸和GABA为其典型代表。它们广泛地分布于中枢神经系统，在中枢神经系统的突触传递过程中发挥着重要作用［5-7］。

　　GluR分为代谢型GluR(mGluR)和离子型GluR(iGluR)，后者可分为NMDA受体和非NMDA受体两类，非NMDA受体又可分为α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸受体(GluR1～4)和KA受体(GluR5～7)［5］。谷氨酸存在于迷走神经传入纤维及其末梢内，谷氨酸对孤束核内感受内脏传入信息的神经元有兴奋作用，这种兴奋性作用与KA受体有非常密切的关系，KA受体还与神经系统一些疾病，如癫痫的发病有关［6］。我们在对照组动物孤束核内观察到中等密度KA受体的GluR5亚型阳性神经元、神经纤维和末梢；KA组动物孤束核内的GluR5阳性结构的密度增加；VNS+KA组动物孤束核内的GluR5阳性结构减少。本研究结果显示，KA受体在KA致癫痫动物的孤束核内表达增加，在VNS抗癫痫时基本恢复至正常水平，提示KA受体在KA致癫痫和VNS抗癫痫过程中均发挥着重要的作用。

　　脑内的GABAA受体至少有α、β和γ 3种不同的亚单位，GABAA受体实际上是由这3种亚单位组成的五角形结构，GABA主要通过作用于GABAA受体而实现其抑制性作用。组成GABAA受体复合物的亚单位不同，导致GABA与其结合后所产生的功能特性不同，其中β亚单位在GABAA受体的组装方面发挥着重要作用。迷走神经初级传入纤维可以激活孤束核内的GABAA受体，通过抑制作用实现VNS的抗癫痫作用。Woodbury等［8］曾提出VNS可能通过引起中枢神经系统的甘氨酸和GABA的释放增加来发挥其抗癫痫作用。Ben-Menachem等［9］在对16例癫痫患者进行VNS治疗前后观察到，VNS治疗后患者脑脊液中GABA的含量明显增加，支持Woodbury等的推测。我们在对照组动物孤束核内观察到中等密度的GABAARβ阳性神经元、神经纤维和末梢；KA组动物孤束核内的GABAARβ阳性结构的密度减少；VNS+KA组动物孤束核内的GABAARβ阳性结构增加。研究结果表明，GABAA受体在KA致癫痫动物的孤束核内表达减少，在VNS抗癫痫时增加，提示GABAA受体在KA致癫痫和VNS抗癫痫过程中均发挥着重要的作用。本研究结果为KA致癫痫和VNS抗癫痫的机制提供了较详实的资料。

　　志谢：　本课题得到第四军医大学解剖教研室李云庆教授的指导并提供部分试剂