雌激素对神经瘤细胞磷酸化的保护作用

　　病(AD)脑组织中最明显的生化异常是微管相关蛋白tau的异常过度磷酸化，异常磷酸化的tau蛋白是双螺旋丝(PHF)的主要成分，并以这种形式在神经元核周围形成神经原纤维缠结。在SH-SY5Y细胞系中，80%的tau蛋白在tau-1表位有高度磷酸化，如同AD中，异常的tau不能参入微管组装，因而SY5Y细胞系成为研究AD细胞骨架改变的细胞模型。

　　绝经期妇女服用雌激素有许多益处。但雌激素在AD中的作用还有争论。群体调查结果表明雌激素可延迟AD发病，降低其发病危险性；在体外实验表明雌激素有神经保护作用。本实验旨在探讨蛋白磷酸酯酶活性缺陷引起的细胞损伤和雌激素的保护作用，为Alzheimer病防治新药的开发提供信息。

　　方法：SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞为K.Iqbal教授赠。细胞用含体积分数为0.05胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养(体积分数为0.05 CO2，37℃)，待细胞生长汇合达70%时，接种到96孔板中，稳定培养48小时后，用于实验。培养结束后，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞1次，每孔加100 μl结晶紫，作用3分钟；去结晶紫，每孔加100 μl 质量浓度为0.01十二烷基硫酸钠(SDS)，37℃温育15分钟。以λ570 nm处吸光度值(A)反映细胞存活率。

　　结果：不同浓度的Okadaic acid(OA)(0、10、25、40 nmol/L)与SY5Y细胞共温育48小时，细胞结晶紫染色，A570值分别为：1.54±0.02，1.55±0.05，0.84±0.03，0.39±0.07，细胞存活率的下降呈剂量依赖关系。5 nmol/L, 10 nmol/L, 15 nmol/L的雌激素和50 nmol/L OA与SY5Y细胞共温育48小时，A570值从1.04±0.14升到1.1±0.16，1.44±0.10*，1.48±0.09*, 差异有显著性意义(*P＜0.05)。

　　应用倒置相差显微镜观察不同组细胞形态。正常细胞有明显突起，胞体大而透亮；加50 nmol/L OA后细胞突起消失，变圆，细胞轮廓变清晰；若加50 nmol/L OA的同时加10 nmol/L，15 nmol/L的雌激素，则细胞出现有突起的外向生长。

　　讨论：在Alzheimer病发展进程中，tau蛋白经历了不同磷酸化程度的变化：从正常胞溶性的c-tau变成异常高度磷酸化的AD P-tau，再经一些不甚清楚的机制转变成PHFⅠ-tau，PHFⅡ-tau。PHFⅡ-tau是无生物活性的。蛋白磷酸酶(PP)-2A，PP-2B可使AD P-tau去磷酸化，甚至使PHFⅡ-tau去磷酸化，从而恢复其促微管组装功能。

　　OA是一种选择性蛋白磷酸酶(PP-1、2A)抑制剂，使细胞内tau蛋白磷酸化，去磷酸化失平衡。大量异常磷酸化的tau蛋白在细胞中堆积，不能形成正常微管，影响细胞骨架结构，所以本实验结果显示随OA浓度增高，细胞突起逐渐消失，细胞存活率进行性下降。

　　同时，本实验结果还显示：低剂量雌激素(E2)对SY5Y细胞保护作用不明显，而大剂量E2对OA处理的SY5Y细胞有明显保护作用，表现在细胞突起的生长和细胞存活率的提高。

　　PC12细胞突起的外向生长与tau表达水平相关。重组tau441转染CHO细胞，发现原为圆形的CHO细胞生长出许多突起，或粗短，或细长，故认为突触的生长发育与重组tau蛋白的表达有关。而雌激素能刺激培养的海马神经元轴突的外向生长，研究认为雌激素提高了tau蛋白水平，这种效应与微管的稳定和轴突生长一致，并发生在前，说明雌激素可选择性诱导tau蛋白表达，从而促进轴突的外向生长，提高细胞存活率。

　　在神经系统中，雌激素能提高胆碱能神经的生长，刺激淀粉样前体蛋白分泌酶的代谢，与载脂蛋白E相互作用，影响AD发病危险性。所以，绝经期后，这些类固醇激素的丧失，可部分解释与AD相关的认知功能减退和神经元退行性变。雌激素可通过受体途径激活基因的转录，影响相关蛋白的表达；还可通过非基因作用，如抗氧化活性，保护神经元免受过氧化物的损伤。而雌激素对OA作用的SY5Y细胞保护作用的机制还有待进一步探讨。