氧自由基对胎鼠海马神经元ATPase和SOM的影响及人参皂甙的保护作用

　　摘　要　目的：观察氧自由基对培养的胚胎海马神经元三磷酸腺苷酶(ATPase)和生长抑素(SOM)含量的影响以及人参皂甙(Gin)的抗自由基作用。方法：在细胞培养第5天给以黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶(X-XO)体系建立氧自由基损伤模型，并分别同时给以Gin超氧化物岐化酶(SOD)以及Gin+SOD，采用组化及免疫组化染色观察各组ATPase及SOM含量变化。结果：X-XO组ATPase及SOM含量均低于对照组及各实验组(P＜0.01)，Gin+SOD及ATPase及SOM含量均高于Gin及SOD)组(P＜0.01)。结论：氧自由基可降低ATP ase和SOM含量， Gin、 SOD可增加ATPase和SOM含量，二者联合应用优于单独应用。 提示Gin可能具有SOD样作用或激活体内SOD作用。

　　脑衰老和早老性痴呆病人的记忆减退或缺失与氧自由基损伤海马神经元有关［1］。三磷酸腺苷酶(ATPase)和生长抑素(somatostatin, sOM)含量的变化是评定细胞代谢活动、反映神经元生理功能的良好指标。本文通过对氧自由基损伤海马神经元ATPase、SOM含量变化的定量研究，探讨氧自由基损伤海马神经元导致记忆减退的病理基础。为人参皂甙(Gin)、SOD的临床应用提供实验依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物　选用健康成年Wistar孕鼠，取18 d胚胎海马神经元进行培养。

　　1.2　培养液及药品　以RPMI 1640为培养基液加入小牛血清(大连产)，终浓度为20%青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml，葡萄糖3 g/L，NaHCO32 g/L，L-谷氨酰胺3 mg/L，调pH至7.2，黄嘌呤(xanthine)，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)，超氧化物岐化酶(SOD)均为Sigma产品，人参皂甙(ginsenosider, gin)由辽宁桓仁中药厂提供，含量为87.8%，所有试剂均用0.15 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)临时配制。

　　1.3　模型制作　取出胎鼠脑海马，剥离脑膜剪碎后用0.25%胰酶消化，37℃30 min，血清培养液终止消化，1 000 r/min离心20 min，去上清加入培养液吹打分散细胞，金属网过滤，计数以5×105/ml浓度接种于涂有鼠尾胶盖片的6孔板，每孔2 ml置CO2培养箱内，培养第5天各孔换培养液1.8 ml，并随机分为5组：(1)正常组：0.2 ml NS;(2) X-XO组：0.1 ml X-XO+0.1 ml NS; (3) Gin组：0.1 ml x-XO+0.1 ml Gin；(4) SOD组：0.1 ml X-XO+0.1 ml SOD;(5) Gin+SOD组：0.1 ml x-XO+0.05 ml Gin+0.05 ml SOD。

　　各药终浓度：黄嘌呤500 μmol/L，黄嘌呤氧化酶2.5 IU/L，SOD125 U/L，Gin 40 mg/L。

　　1.4　染色方法及数据处理　取给药后24、28 h培养的细胞行酶组化染色和SOM免疫组化染色，每组随机选取50个ATPase、SOM染色细胞，采用LUZEX-F图像分析仪分别测定其灰度值，所得数据输入SAS软件进行统计学分析处理。

　　2　结果

　　2.1　各组神经元ATPase含量观测

　　ATPase染色标本可见，X-XO组神经元酶颗粒明显增多，着色深。经显微图像分析，各组灰度值见表1。

表1　各组神经元ATPase含量(X±s)

　　tab.1　The ATPase content of neurons from different

　　groups at different hours(X±s)

组　别	n	灰　度　值
		24 h	48 h
X-XO组	50	150.12±6.13	154.12±6.54
正常组	50	103.80±4.98*	102.36±5.43*
Gin组	50	132.48±5.78*	133.35±5.69*△
SOD组	50	134.33±5.67*△	134.58±5.74*△
G+S组	50	110.73±5.44*	112.54±5.40*

　　与X-XO组比较　*　P＜0.01

　　Gin，SOD组与G+S组比较　△ P＜0.012.2　各组神经元SOM含量观测

　　SOM免疫染色标本可见自由基组神经元SOM阳性细胞数减少，着色浅，其它各组神经元阳性细胞数增多，着色深。显微图像分析结果见表2。

　　上述结果提示，自由基组神经元ATPase、SOM灰度值与其它各组比较均有显著性增高(P＜0.01)，而Gin、SOD组与Gin+SOD组相比，其灰度值也明显增高(P＜0.01)，说明自由基组神经元ATPase、SOM含量降低，Gin+SOD组神经元ATPase、SOM含量高于Gin组和SOD组。

表2　各组神经元SOM含量(X±s)

　　tab.2　The SOM content of neurons from different

　　groups at different hours(X±s)

组　别	n	灰　度　值
		24 h	48 h
X-XO组	50	130.29±6.35	134.12±6.13
正常组	50	110.43±5.20*	110.73±5.15*
Gin组	50	123.47±5.51*△	124.33±5.68*△
SOD组	50	124.73±5.48*△	124.43±5.52*△
G+S组	50	111.83±5.67*	110.76±4.97*

　　与X-XO组比较　*　P＜0.01

　　Gin，SOD组与G+S组比较　△ P＜0.013　讨论

　　3.1　氧自由基对神经元ATPase、SOM含量的影响

　　ATPase主要分布于细胞膜、线粒体中，膜结合的ATPase在Na+、K+经膜转运中起重要作用。线粒体ATPase水解ATP为ADP，释放磷酶基，产生大量能量，供机体代谢需要。因而ATPase组化染色是细胞代谢活动状态评定的良好指标［2］。本研究应用鄂征介绍的活细胞酶性ATPase染色法［3］，结果满意。正常组神经元可见酶反应颗粒主要位于胞浆内，部分神经元胞膜着色。氧自由基组酶反应颗粒明显减少，定量分析结果表明自由基可以降低ATPase活性，导致神经元代谢障碍。

　　SOM作为神经递质或激素或调制物来实现其调节作用，且参与学习和记忆。不少学者认为，老年性痴呆时含SOM的神经元的神经递质明显减少［4］，海马各区均含有SOM mRNA阳性神经元［5］。本实验结果显示氧自由基SOM阳性神经元数量明显减少，神经元合成SOM多肽明显减少。这可能是海马神经元氧化损伤导致记忆减退的重要原因。另有报道SOM在中枢神经系统内起着神经营养作用，SOM能诱发神经突起的萌发，缺乏SOM会导致小脑发育障碍［6］。我们分析认为SOM阳性神经元损伤导致海马神经元失养，可能会加速细胞损伤。通过提高SOM含量增强海马神经元功能活动可能是减缓记忆减退的有效途径。

　　3.2　人参皂甙、SOD对海马神经元的保护作用

　　人参及其酚性成分具有抗自由基氧化作用［7］。本实验结果显示人参皂甙、SOD均能有效地对抗氧自由基对海马神经元的损 伤， 使ATPase和SOM含量增加，并且Gin+SOD联合用药明显强于单独应用。我们推测人参皂甙可能通过直接作用或激活细胞内SOD活性稳定膜系统，增强酶活性，增强神经元合成递质(神经肽)的能力，从而增强海马神经元抗自由基能力。SOD可直接清除氧自由基从而保护神经元酶活性和神经肽SOM的合成。但也有学者指出：高剂量SOD可能没有神经保护作用或许还有害［8］。因而多种抗氧化剂低剂量联合应用，可减少毒副作用，其协同作用又提高了抗氧化能力。本实验结果提示合理联合用药可能开辟一条增强机体抗衰老能力的新途径。

　　辽宁省自然科学基金资助项目，972232章培军，研究生，山西省大同医专解剖教研室章培军（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳110001)

　　吕永利（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001)

　　赖红（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001)

　　高杰（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001)

　　王铁民（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001)

　　李洪鹏（中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001）

　　参考文献

　　1，Pellmar tC, Hollinden GE, Sarvey JM. Free radicals accelerate the decay of long-term potentiation in field CAl of guinea-pig hippocampus. Neuroscience,1991,44(2):353-359

　　2，陈啸梅，周文郁，彭俊云，等.组织化学手册.第1版，北京：人民卫生出版社，1982.125～152

　　3，鄂征.组织培养技术.第1版，北京：人民卫生出版社，1985.58～156

　　4，朱长庚.生长抑素.神经解剖学杂志，1986，2(2)：161～164

　　5，向正华，蔡文琴，孟琳，等.生长抑素mRNA在大鼠前脑中的分布.解剖学杂志，1996，19(1)：25～28

　　6，Hogan D, Nancy E, Berman J. The development of somatostatin immunoreactive neurons in cat visual cortical areas. Developmental Brain Res, 1993,71:221-224

　　7，胡卓逸，史建勋.人参培养物中SOD活力测定.中国药科大学学报，1996，27(11)：687～690

　　8，Vyama O, Matsuyama T, Michishita H, Protective effects of human recombinant superoxide dismutase on transient ischemic injury of CAl neurons in grebils. stroke, 1992,23(1):75-78