大鼠全脑缺血再灌注后海马区细胞凋亡及bcl-2和Bax的检测

www.cnkang.com 2007-3-21 14:21:00 中华康网

　　摘　要　目的：证实缺血性脑损伤主要是以细胞凋亡的方式发生。方法：用TUNEL法标记检测损伤的神经细胞，用原位杂交组织化学法检测bcl-2 mRNA，用免疫组织化学法检测Bax蛋白。结果：手术组检测到TUNEL标记的阳性神经细胞主要位于海马CA1区，渐进性增多，第3天达到高峰，可检测到凋亡小体和正在形成凋亡小体的神经细胞。bcl-2主要在海马CA3区表达,Bax则主要在CA1区表达，两者均于再灌注8 h出现，24 h阳性信号达到高峰，72 h明显下降。结论：细胞凋亡是大鼠全脑缺血后海马区神经元丢失的重要原因，大鼠全脑缺血再灌注后海马区bcl-2 和Bax 的区域性表达可能参与海马不同区域缺血耐受性差异的形成。

　　关键词：脑缺血　凋亡　海马　基因,bcl-2

　　近年研究发现脑缺血再灌注后损伤呈进行性加重，其中海马区为易损伤区，机制不明。本研究是以四血管阻塞法制备的大鼠全脑缺血模型为工具，从形态学角度及基因和蛋白质水平研究凋亡在大鼠海马区缺血再灌注后神经细胞损伤中的作用。

　　1　材料和方法

　　1．1　全脑缺血模型的制备　参考Pulsinelli［1］方法略作改动制备了四血管阻塞全脑缺血模型。用水合三氯乙醛（300 mg/kg）麻醉SD大鼠（购于必凯公司）,电凝阻断双侧椎动脉；在颈总动脉下放置丝线并打一活结外置备用。24 h后大鼠完全清醒，夹闭颈总动脉20 min，后放开血管夹，脑血流再通。实验共分为3组：手术组、假缺血组、正常对照组(n =3)。假缺血组：制备同手术组，但不夹闭双侧颈总动脉。

　　1.2　取材切片　SD大鼠在相应时间点杀死,常规心脏灌流固定，取出前脑，在灌注固定液(4%的多聚甲醛和0.3%的饱和苦味酸混合液)后固定6～12 h，然后浸入20 %的蔗糖PBS(pH7.2)中脱水。用原位末端标记(TUNEL)法检测的大鼠手术组按照缺血再灌注时间分为再灌注第1,2,3,5,7,9,14天7组（n =3），假缺血组(n =3)同第3天手术组一同处死。用恒冷箱切片，片厚10 μm。原位杂交和免疫组化实验手术组则分为再灌注8,16,24,48,72 h 5组(n =3)，对照组(n =3)同24 h 组一同处死。大鼠前脑用冰冻连续冠状切片，片厚40 μm，并按奇偶数将切片分为2组,切后再入相应的固定液中固定4 h。

　　1.3　TUNEL法原位检测细胞凋亡　参考本实验室方法［2］，标记损伤的神经细胞。用计算机图像仪处理TUNEL染色片，计算阳性神经细胞(核)数/mm2，每只大鼠取3张切片，每个时间点3只大鼠，并进行t 检验。

　　1.4　免疫组织化学染色　将奇数组漂浮切片与Bax抗体（购自Boster,Bax试剂盒）37℃孵育40 min，按试剂盒提供的方法染色后常规封片。

　　1.5　地高辛精标记bcl-2 cRNA探针的制备和原位杂交　含有850 bp的大鼠bcl-2 cDNA 的pbluebcl-2质粒（楼立广博士惠赠）。经转化入细菌，扩增并提纯后，用BamH Ⅰ切开使之线性化，体外转录合成地高辛精标记bcl-2 cRNA探针。参考本实验室方法原位杂交［3］，地高辛核酸探针含量40 ng/μl。

　　1.6　结果分析　将原位杂交和免疫组织化学染色结果用图像处理仪(Olympus BH-2)进行定量灰度扫描。每个时间点取3张切片，每张切片在两边和中央各取5个细胞，求其阳性信号的平均灰度值，将各值取倒数，计算比较各自的表达量，并进行t 检验。

　　2　结　果

　　2.1　TUNEL法检测凋亡细胞　手术组TUNEL标记阳性神经细胞主要位于海马CA1区,手术组可见大量的标记阳性细胞(图1 A,图见封三) ，胞体为锥状，有长突起，阳性信号呈紫蓝色；假缺血组仅见个别阳性细胞（图1 B)，正常对照组未见细胞凋亡。阳性细胞信号强弱不等：高倍镜下显示出深染和浅染的两种细胞，其中深染的细胞可见有的阳性信号位于核内，有的不仅位于核内且弥散于胞质及突起，浅染的细胞其阳性信号弥漫于胞体中且胞体界限不明显(图1 C)。在高倍镜下还见到有些细胞在核周质靠近胞膜处有数个散在的深染的圆形颗粒状结构（图1 D），这可能是即将形成凋亡小体的神经细胞。CA1区TUNEL染色图像分析结果表明,缺血再灌注第3天海马CA1区TUNEL-细胞数目和密度最高(P＜0.01)，第7天后开始减少，第14天时阳性细胞基本消失(P ＜0.01)。

　　2.2　bcl-2 mRNA原位杂交结果　(1)正常组和假缺血组海马CA3区没有检测到bcl-2 mRNA。手术组缺血后8 h即可在CA3区检测到bcl-2 mRNA阳性神经元，但信号较弱，缺血24 h，bcl-2 mRNA阳性神经元数目最多，主要是CA3区的锥状神经元，阳性信号主要分布于神经元胞体和突起中，细胞核淡染（图1 E）。CA1区可偶然见到bcl-2 mRNA阳性神经元，但数目极少。(2)计算机图像分析结果表明，缺血再灌注8 h后CA3区出现bcl-2 mRNA表达， 24 h达到高峰（与对照组比较，P＜0.01），72 h明显减少（与24 h组比较，P＜0.01）。

　　2.3　Bax免疫组织化学　(1) 阴性对照组（正常组和假缺血组）海马区未检测到明显的Bax阳性神经元。缺血后16 h CA1区的Bax免疫组织化学染色阳性的锥状神经元和DG区阳性的颗粒细胞数目和密度都显著升高。24 h CA1区阳性信号达到高峰，阳性信号主要分布于神经元胞体和突起中，细胞核处淡染（图1 F）,以后下降，72 h下降幅度较大。(2)计算机图像分析结果表明，缺血再灌注后8 h在海马CA1区出现Bax阳性细胞(与阴性对照组比较，P＜0.01），随着再灌注时间的延长，阳性信号逐渐增强，到24 h到达高峰（与阴性对照组比较，P＜0.01），72 h明显减少（与24 h组比较，P＜0.01）。

　　3　讨　论

　　对缺血引起的脑损伤主要有两种观点：一种认为缺血性脑损伤是由坏死造成的；另一种认为神经细胞的凋亡导致了再灌注后损伤的加重。本实验利用目前对凋亡特异性较高的TUNEL法标记检测大鼠全脑缺血再灌注后海马区损伤的神经细胞，同时从基因和蛋白质水平检测与凋亡关系密切的分子bcl-2和Bax在海马区的表达。

　　3.1　TUNEL法检测凋亡细胞的特异性　TdT酶介导的原位末端标记法,即TUNEL法是目前原位检测凋亡特异性较高的一种方法。有人认为TUNEL仅特异性地标记凋亡细胞而不能标记坏死细胞，而本实验中存在TUNEL标记强弱不同的两种神经细胞，图1C中存在两种信号。细箭头所示的强阳性信号，深染，细胞界限清楚；粗箭头所示的弱阳性信号，浅染，同时伴有细胞水肿且界限不清。这与Charriaut-Marlangue等［4］对暂时性局部脑缺血的报道类似。这可能是由于细胞坏死时DNA断裂具有随意性，3′-OH 断端量较少，信号较弱; 而凋亡则产生大量的3′-OH断端，故阳性信号较强。因而本实验中信号较弱的且界限不清楚的可能为坏死的神经细胞，较强的可能为凋亡的神经细胞。

　　3.2　凋亡的发生与bcl-2和Bax的区域性表达　正常对照组大鼠海马区未发现凋亡的神经细胞；假缺血组在海马CA1区见到数个散在的凋亡细胞，这可能是因为电凝椎动脉手术作为一种外伤刺激引起的。缺血组中可明显见到渐进增多的凋亡的神经细胞，且以海马CA1区的锥状神经元为主，第3天时该区锥状神经元凋亡数目到达高峰，而此区是缺血后Bax表达最早出现变化和表达数量最多的区域；CA2区Bax表达变化较小，而此处神经元凋亡的数目也相对较少；DG区只是偶尔出现凋亡的神经细胞，而此处Bax表达增多甚微；CA3区基本没有变化，而此处是Bcl-2 mRNA阳性信号最强的区域，此区的神经细胞基本没有凋亡；其次在DG区的颗粒细胞中也有Bcl-2 mRNA的阳性信号。有研究指出在bcl-2家族中 Bax是与 bcl-2相互拮抗的［5］。当bcl-2过量时，形成bcl-2同源二聚体，细胞受到保护；当Bax过量时，形成Bax同源二聚体，细胞则趋向死亡。全脑缺血后海马区很可能有大量的 bcl-2 mRNA表达的神经细胞（包括DG区的颗粒细胞）受到Bcl-2同源二聚体的保护而不至于死亡；而Bax大量表达后拮抗Bcl-2，而导致相应神经元群死亡，其详细机制还不清楚。

　　实验表明,大鼠全脑缺血后海马区延迟性神经元死亡是不同于坏死的一个过程；凋亡是大鼠全脑缺血后海马区神经元丢失的重要原因。全脑缺血再灌注后,海马各区两种功能相反的凋亡相关基因bcl-2 和Bax的区域性表达很可能参与了延迟性神经元死亡的发生。

　　参考文献

　　1　Pulsinelli WA,Brierley JB. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke,1979,10(3):267

　　2　刘善荣，孟　. 大鼠暂时性全脑缺血再灌后海马区凋亡检测. 解剖学杂志,1998，21（3）：206

　　3　向正华，蔡文琴，刘淑琴，等。用非同位素原位杂交组化在光镜和电镜水平观察前阿黑皮素mRNA在垂体的分布. 解剖学杂志，1994，17（2）：135

　　4　Charriaut-Marlangue C, Margaill I , Represa A,et al. Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia:an in situ DNA fragmentation analysis. J Cerel Blood Flow Metab,1996,16(2):

　　186

　　5　Korsmeyer SJ. Regulators of cell death. TIG,1995, 11(3): 101