腺病毒介导反义IGF-1抑制鼠胶质瘤细胞增殖的实验研究

　　【摘要】　目的　重组腺病毒反义IGF-1基因(AdHCMV-IGF-1A)治疗大鼠C6胶质瘤。方法　体外克隆反义IGF-1300bp基因片段重组入腺病毒，经扩增纯化，测定滴度，体外体内感染C6胶质瘤细胞，观察IGF-1的表达及肿瘤大小、生存期变化。结果　重组腺病毒反义IGF-1滴度6.5×1010pfu/ml，反义IGF-1基因序列正确，体外C6-Ad-IGF-1A的IGF-1表达降低，Ad-IGF-1A治疗皮下C6肿瘤细胞接种组，肿瘤完全消失。与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，Ad-IGF-1A治疗脑内C6肿瘤细胞接种组，大鼠生存期超过90天，而对照组分别为16.5±1.4天(Ad-lacz组)、15.7±1.6天(生理盐水组)，P＜0.001。结论　重组腺病毒反义IGF-1可抑制C6细胞IGF-1的表达，AdHCMV-IGF-1A治疗大鼠C6胶质瘤效果显著。

Adenovirus mediated antisense IGF-1 gene therapy for rat glioma

LI Xiangdong, HUI Guozhen, LU Daru, et al.

　　Department of neurosurge ry, The First Affiliated of Suzhou Medical College, Suzhou 215006

　　【Abstract】　Objective　To observe the treat me nt effect of rat C6 glioma with recombinant adenovirus antisense IGF-1 gene (Ad HCMV-IGF-1A).Methods　Antisense IGF-1 gene of 300 base pairs was colon e d into adenovirus. The recombinant adenovirus was amplified, purified and assess ed of the titer. The C6 glioma cells were transfected by the recombinant adenovi rus in vitro and in vivo. The expression of IGF-1 in vitro and tumor size, surv iv al of tumor-bearing rats were observed.Results　The tite r of recombinant adenovirus was 6.5×1010pfu/ml. The expression of IGF- 1 in C6 cells transfected by AdHCMV-IGF-1A was decreased. When the rats of C6 su bcu taneons glioma were treated with AdHCMV-IGF-1A, the tumors all disappeared wh il e as the tumor size of control was significantly large. When the rats of C6 intr acr anial glioma were treated with AdHCMV-IGF-1A, AdlacZ, saline solution the su rv ivals were 90 days, 16.5±1.4 days, 15.7±1.5 days respectively (P＜0. 001).　Conclusion　The expression of IGF-1 of C6 could be suppre s sed by AdHCMV-IGF-1A. Recombinant adenovirus antisense IGF-1 had great effec t in treating rat C6 glioma in vivo.

　　【Key words】　Antisense gene therapy　C6 glioma　Adenovirus vector　IGF-1

　　恶性肿瘤的发生与某些生长因子的异常表达密切相关，胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)就是其中一种。原发性人脑星形细胞瘤和大鼠脑胶质细胞系C6都存在IGF-1的增高，IGF-1的高水平表达通过自分泌环作用促进肿瘤细胞的生长和增殖，并维持肿瘤细胞恶性表型。本实验通过克隆IGF-1翻译起始位点300bp的反义片段，制备重组腺病毒反义IGF-1，基因治疗C6大鼠脑胶质瘤，探讨其作用机理，为反义基因治疗脑肿瘤提供基础。

　　材料和方法

　　一、材料

　　各种限制性内切酶、T4-DNA连接酶、AMV反转录酶、Taq酶等为美国NewEnglandBiolabs公司产品，大鼠脑胶质瘤C6细胞由第二军医大学病理教研室提供，IGF-1引物由中科院植物生理研究所合成，引物P1：5'　TTGCCTCATTATTCCTGC3'　。引物P2：5'　CTGGAGGCCATAGCCTGTGG3'　。pJM17和人胚肾细胞293细胞由刘国卿博士赠送(UniversityofBritishColumbia,Canada)腺病毒LacZ由复旦大学遗传所提供，SD大鼠购于第二军医大学动物中心，大鼠脑立体定向仪为上海产江湾1型，IGF-1抗体购自SantaCruz生物技术公司，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品。

　　二、方法

　　1.细胞培养：C6细胞、293细胞用高糖DMEM培养液，常规加入10%小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml。

　　2.反义IGF-1基因的克隆：取1×106细胞，抽提细胞总RNA，加入IGF-1引物，70℃变性10分钟，冰浴条件下加入反转录反应液和反转录酶，37℃1小时，42℃30分钟，70℃15分钟。取部分反应液作PCR检测，加入适量引物、dNTP、Mg2＋、缓冲液、水和Taq酶。95℃变性300秒，48℃退火30秒，72℃延伸60秒。从第二循环开始变性时间为30秒，如此35次循环最后72℃300秒，PCR产物于1.8%琼脂糖凝胶电泳分析。将DNA片段柱式回收，连接入pGEM-T载体，鉴定反向插入的克隆，构建入pAdHCMV质粒为pAdHCMV-IGF-1A。

　　3.测序：取反向插入IGF-1的pGEM-T克隆，进行自动测序仪分析。

　　4.重组腺病毒反义IGF-1制备：将pAdHCMV-IGF-1A与pJM17采用磷酸钙沉淀法共转染293细胞，挑取噬斑，得到重组腺病毒(Ad-IGF-IA)。重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定按文献进行。PCR检测重组腺病毒内含目的基因。

　　5.细胞的体外增殖试验：用MOI=100的Ad-IGF-1A和Ad-lacZ感染C6细胞，37℃5%CO2孵育4小时，DMEM洗两遍去除游离的病毒，加入常规培养基，5天后，用MTT法测定，结果用570nm的OD值计算。

　　6.免疫组化试验：感染Ad-IGF-1A的C6、亲本C6进行ABC法免疫组化染色，Ad-lacZ感染的C6进行x-gal染色。

　　7.大鼠C6胶质瘤皮下及脑内肿瘤模型的建立及重组腺病毒原位治疗：SD雄性大鼠，每组10只，体重250g～300g，分别于右腿皮下接种1×107C6细胞，每3天测定皮下肿瘤大小，肿瘤大小用长径×短径计算。脑内接种组记录大鼠的存活期，对于存活期大于90天的荷瘤鼠，其存活期记为90天。脑内肿瘤模型：麻醉后固定于立体定向台上，手术暴露颅骨标志，于前囟中点前1.0mm，矢状缝旁3.5mm，颅骨下5.0mm，微量注射器接种C6细胞1×106／10μl。皮下、脑内接种后第三天用Ad-IGF-1A原位治疗，大鼠重新固定于立体定向台上，沿原道注入10μl腺病毒。病毒注射后5天，每组两只断头处死，作病理检查。实验分六组(1)Ad-IGF-1A皮下治疗组。(2)Ad-lacZ皮下治疗组(3)生理盐水皮下治疗组(4)Ad-IGF-1A脑内治疗组(5)Ad-lacZ脑内治疗组(6)生理盐水脑内治疗组。

　　结果

　　1.反义IGF-1基因的克隆：RT-PCR从C6细胞中扩增得到300bp基因片段，其中含BglⅡ酶切位点，根据其BglⅡ酶切点鉴定反向pGEMT-IGF-1克隆，自动测序仪分析序列完全正确。

　　2.重组腺病毒AdHCMV-IGF-1A的制备：把pGEMT-IGF-1A中反义IGF-1A片段通过中间质粒pBS、pCEP4连接入pAdHCMV，酶切鉴定正确，与pJM共转染293细胞，挑取噬斑，PCR鉴定存在有IGF-1A片段，扩增、纯化病毒，并测定滴度为6.5×1010pfu/ml。

　　3.体外增殖试验：C6-Ad-IGF-1A、C6-Ad-lacZ、C6亲本细胞5天内体外增殖能力无显著性差别(P＞0.05)。

　　4.免疫组化结果：用ABC法染色见C6肿瘤细胞有褐色着色，C6-Ad-IGF-1A无细胞内染色，C6-AdlacZ近100%呈蓝色(图1、2、3)。

　　讨论

　　反义基因治疗是胶质瘤基因治疗的重要内容，由于胶质瘤的发生是由于各种癌基因激活或抑癌基因的失活引起，并与多种生长因子的异常表达密切相关。利用反义基因技术可抑制多种癌基因及生长因子的过度表达，使肿瘤细胞表型逆转，抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡。我们应用腺病毒介导反义IGF-1体内外治疗皮下和脑胶质瘤，取得明显的抑瘤效果，为进一步应用反义技术治疗脑肿瘤奠定基础。

　　胰岛素样生长因子-1是一类具有胰岛素样生长刺激活性及免疫调节的多肽分子。在正常人脑中，IGF-1仅存在于胎儿期，出生后消失，IGF-1需和其受体IGF-1R结合才能发挥作用，并且IGF-1是胶质瘤细胞的有丝分裂原，人脑胶质瘤高表达IGF-1，IGF-1促进肿瘤细胞生长和增殖，其作用机制是IGF-1和其受体结合，通过自分泌环使肿瘤细胞无限增殖，并维持肿瘤细胞恶性表型使肿瘤呈浸润性生长。我们通过反义IGF-1抑制IGF-1的表达，免疫组化证实其可行性。腺病毒载体宿主广泛，滴度高，易纯化，可直接活体注射，更接近于临床应用，目前有更多的肿瘤基因治疗临床方案采用腺病毒作为载体。本实验应用腺病毒介导反义IGF-1治疗大鼠脑内及皮下肿瘤，使肿瘤完全消失，大鼠长期存活，抑瘤效果达100%。

　　反义IGF-1治疗肿瘤的机理有两种，一是阻断IGF-1的自分泌环作用，使肿瘤细胞生长受到抑制。二是改变肿瘤细胞表型，激发机体免疫应答反应，能使肿瘤细胞MHC-1类抗原及B表达增高。Trojan［2，3］应用pREP质粒表达反义IGF-1转染C6细胞，能完全抑制荷瘤鼠肿瘤生长，并发现肿瘤原位有大量CD＋8淋巴细胞浸润，Lafarge-Frayssinet［4］进一步研究发现转染反义IGF-1的肿瘤细胞表面MHC-1和B较亲本细胞明显增高。Shevelev［5］应用反基因技术也证实转染反义IGF-1的C6细胞MHC-1类抗原表达增高。由此，反义IGF-1基因治疗脑肿瘤主要依赖于改变肿瘤细胞恶性表型，提高肿瘤的免疫原性，诱导机体识别免疫耐受的肿瘤组织，产生特异性抗肿瘤的免疫反应，这是反义IGF-1基因治疗最为有效、最令人鼓舞的作用机制之一。我们的实验也证明了反义IGF-1治疗组肿瘤组织内有大量淋巴细胞浸润，杀伤肿瘤细胞，与文献相符。

　　 注：本研究为江苏省科委及卫生厅重大科研资助项目

　　参考文献

　　1　Cruiel DT, Agarwarl S, Wagner E, et al. Adenovirus enhancemen t of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci, 1991,8 8:8850-8854.

　　2　Trojan J, Johnson TR, Rudin SD, et al. Treatment and prevention of rat glioblastoma by C6 cells expressing antisense IGF-1RNA. Science, 1993, 259:94 -97.

　　3　Trojan J, Blossey BK, Johnson TR, et al. Loss of tumorigenicity of rat glioblastoma directed by episome-based antisense cDNA transcription of insulin -like growth factor-1. Proc Natl Acad Sci, 1992, 89:4874-4878.

　　4　Lafarge-Frayssinet C, Duc HT, Frayssinet C, et al. Antisense insulin -l ike growth factor-I transferred into hepatoma cell line inhibits tumorigenesis b y modulating major histocompatibility complex 1 cell surface expression. Cancer Gene Ther, 1997, 4:276-285.

　　5　Shevelev A, Burfeind P, Schulgy E, et al. Potential triple helix-medi a ted inhibition of IGF-1 gene expression significantly reduces tumorigenicity of glioblastoma in an animal model. Cancer Gene Ther, 1997, 4:105-112.