神经胶质瘤的反义治疗研究进展

　　神经胶质瘤为中枢神经系统常见肿瘤，目前所有治疗措施(如：手术切除、化学治疗、放射治疗和免疫治疗等)的疗效和应用潜力都极为有限，近年来，随着分子生物学的研究进展，反义基因治疗脑瘤，尤其是神经胶质瘤，取得了飞速的发展，细胞培养和动物实验均取得令人振奋的成果，从而为神经胶质瘤的病因治疗开辟了新的道路［1］。本文将就此做一简要综述。

　　一、反义基因治疗概述

　　目前认为肿瘤的发生与原癌基因的激活和抑癌基因的失活有关。原癌基因与抑癌基因都是正常细胞内正常存在的基因，它们编码的产物多为信号传导系统中的一些效应分子。这些基因及其编码的产物对细胞的正常生长和分化有重要作用，但当这些基因发生突变，即原癌基因激活或抑癌基因失活后，会造成信号传导系统的紊乱，影响细胞的正常生命过程，继而发生肿瘤。尤其是癌基因的过度表达，其编码的生长因子及其受体大量产生，以自分泌及旁分泌的形式促使肿瘤细胞无限生长

　　反义基因治疗依据碱基互补原理，应用能与目的基因或其mRNA互补的核酸，通过空间阻遏作 用，或诱导RNase H活性，或与目的DNA双股螺旋形成三聚体(triple helix)，在基因复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译水平上，抑制蛋白质合成的特性，抑制癌基因的表达，抑制生长因子的分泌或封闭其受体，以期阻断癌细胞内的异常信号传导及自分泌和旁分泌环路，使癌细胞进入正常化轨道或引起癌细胞凋亡［2］。反义核酸包括反义核糖核酸(antis ence RNA)、核糖酶(ribozyme)和反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides, AONs)三类。

　　1.反义核糖核酸：反义RNA是将特异的反义基因连到特定的表达载体(质粒、病毒)，并导入靶细胞的相应mRNA的基因位点上反向转录形成的RNA，它的一级结构与相应的mRNA高度互补，从而能形成RNA双链杂交分子。这种RNA杂交体既能直接影响mRNA与核糖体结合，又为对RNA双链体敏感的RNaseIII和RNaseH提供了适当的降解底物。反义RNA还能与DNA起始位点上的RNA引物竞争，干扰DNA的复制；与DNA结合形成类似的转录衰减子结构，降低转录效率，与DNA结合形成假的转录终止信号；与mRNA编码区结合，封闭mRNA的起始密码，阻止翻译过程的进行［3］。

　　2.核糖酶：Ribozyme是一类天然的、具有酶催化活性和自我剪切功能的RNA，它由双臂及其中间的锤头两部分构成，其两臂与目的RNA互补，相当于一种反义RNA，中间的锤头为催化部位，一旦两臂与目的RNA结合，则催化部位即将目的RNA中敏感的磷酸二酯键切断降解，阻止翻译过程［3］。

　　3.反义寡核苷酸：AONs及其衍生物是一些人工合成的反义核酸，均为小分子物质，一般由15～21个核苷酸聚合而成，为一短链，其特有的核苷酸序列决定了它能与靶DNA或靶RNA的碱基互补，阻止这些异常基因的表达，从而达到治疗癌症的目的［2］。由于其具有分子量小、易于人工合成、基本无毒、在细胞内与靶RNA形成杂交体的Tm值低等优点，故成为反义核酸中广为使用的重要类型。然而，未经修饰的磷酸二酯AONs对核酸酶敏感，易被快速降解，故半衰期很短，仅为几小时，甚至不足15分钟［4，5］。此外，由于其磷酸骨架带负电荷，难于穿越细胞膜，故细胞穿透能力较差［6］。为提高AONs的稳定性，延长半衰期和增加细胞穿透能力，学者们采用化学修饰的方法已研制出多种AONs的衍生物，如：甲基磷酸AONs［4］，硫代磷酸AONs［3］，α-AONs［6］，结合型AONs［7］等。为使AONs顺利进入靶细胞发挥治疗作用，靶向性转运至关重要。直接注射存在AONs易降解、细胞摄取率不高、非特异性结合降低了AONs的药效以及对mRNA的非特异性阻断等诸多问题。为此，人们试用以下方法改善靶向性转运。(1)将AONs与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(2)AONs与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(3)用脂质体包裹AONs后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(4)AONs与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(5)用免疫脂质体转运AONs可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(6)将AONs体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将AONs载入靶细胞内；(7)电打孔(electroporation)，即借助于电流将AONs导入靶细胞［6，8］。

　　二、神经胶质瘤的反义治疗

　　近年来，神经胶质瘤的反义治疗已取得许多可喜的成果。

　　Behl等在体外以AONs抑制恶性神经胶质瘤HTZ-146和HTZ-17两种细胞系的细胞增生，发现碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA的反义分子使HTZ-146细胞增生减少50%，而对HTZ-17无效；血小板衍生生长因子A链(PDGF-A)mRNA的反义分子使HTZ-17细胞增生减少45%，而对HTZ-146细胞无效。两种细胞均不受PDGF-BmRNA的反义分子抑制［9］。

　　将C6细胞向动物颅内接种后形成颅内肿瘤模型，然后立即行胰岛素样生长因子1(IGF-1)反义基因转染的C6细胞注射。4个月内，实验组动物无一发生颅内肿瘤，而未注射转染基因细胞的动物则都有明显的肿瘤形成［10］。

　　转化生长因子-β2(TGF-β2)由胶质瘤细胞自分泌产生，这种蛋白质为肿瘤免疫抑制因子，大量TGF-β2的表达会抑制机体免疫功能，使肿瘤细胞逃避免疫监视及免疫细胞的攻击而得以大量生长。业已证实TGF-β2的AONs可消除TGF-β2的这种免疫抑制作用。在HTZ-153和HTZ-209恶性胶质瘤细胞及HTZ-243恶性星形细胞瘤细胞的培养基内加入TGF-β2的AONs后，肿瘤细胞自体毒性增加60%，Western印迹杂交法显示，TGF-β2蛋白浓度下降，其免疫反应性降低，从而导致其mRNA表达形式的改变［11］。

　　反义核酸不仅影响生长因子，对其受体也有影响。如IGF-1R在成熟胶质细胞中不表达，而在神经胶质瘤细胞中都普遍表达，若将IGF-1R的反义RNA导入C6神经胶质瘤细胞，则阻断PDGF引起的生长作用，细胞在软琼脂上的集落形成减弱［12］。

　　AONs对细胞内蛋白也有影响。由于PDGF-B由C-sis原癌基因编码，故与C-sismRNA互补的AONs可抑制恶性胶质瘤A-172细胞系的细胞增生，AONs阻遏了A-172细胞内C-sis蛋白的再合成［13］。

　　在恶性胶质瘤细胞中，C-myb呈10倍扩增，而C-myb编码的蛋白又促使肿瘤细胞的增生，故与C-myb互补的AONs可用来抑制肿瘤细胞的增殖。将硫代磷酸AONs加至C-myb的5’帽启动区并培养48小时后发现，U87、U373、T98神经胶质细胞及DAOY神经母细胞瘤细胞的平均增生量分别为对照组的20%、52%、53%和53%。AONs加至反式活化序列后，增生量分别为对照组的25%、76%、61%和45%［14］。

　　蛋白激酶Cα(PKCα)介导许多生长因子、激素的信息传递，与肿瘤细胞的增殖有关。将PKCα的反义互补AONs导入人神经胶质瘤细胞株，可使PKCα活性减少95%，肿瘤细胞体外倍增时间延长，且肿瘤细胞不能在裸鼠皮下形成肿瘤［15］。

　　由于绝大多数肿瘤细胞都有端粒酶(telomerase)表达，端粒酶通过合成端粒(telomere)DNA序列补光端粒丢失，是肿瘤细胞得以无限增殖，获得永生的必要条件。神经系统肿瘤，尤其是神经胶质瘤更甚，如：多形性恶性胶质瘤细胞中端粒酶活力阳性率达75%，少突神经胶质瘤细胞中竟达100%［16］。因此，端粒酶已成为当今最引人注目的抗肿瘤治疗新突破口，端粒酶的反义核酸有望成为一类广谱、低毒的新型抗肿瘤药物。Feng等发现结合于端粒酶RNA部分的反义分子在体外能杀死肿瘤细胞。他们从新鲜肾细胞克隆出人的端粒酶RNA，并产生一条反义的硫代磷酸(phosphorothioate,PS)寡聚物，再从该反义寡聚物抑制Hela细胞的端粒酶活力，使端粒DNA序列逐渐丢失，经23～26个细胞分裂周期之后，这些细胞开始死亡［17］。Norton等认为尽管反义PS寡核苷酸能有效抑制端粒酶活力，但该寡聚物须有一定的长度(18～40个核苷酸)，其特异性较差，所需浓度较高，建议以更为有效的肽核酸(peptide nucleic acids, PNAs)取代PS寡聚物。PNAs为经过化学修饰的寡粒苷酸，含有一个非离子骨架，其脱氧核糖键由二氨基乙烯甘氨酸取代，故PNA核苷酸链间不带电荷，从而溶解温度增加，抗蛋白酶或核酸酶的能力随之大为增强，低浓度(微微摩尔/升至毫微摩尔/升浓度)便能有效抑制端粒酶活力，比PS寡聚物的效力高50倍；PNAs还能准确识别hTR的RNA组分，其特异性和亲和力均明显优于PS寡核苷酸［18］。上述研究无疑为神经胶质瘤的反义治疗带来了新的希望。

　　尽管反义核酸治疗神经胶质瘤有广泛的开发前景，但真正用于临床还需要进行许多工作。这是由于神经胶质瘤的形成与多种生长因子及其受体、癌基因及突变抑癌基因有关，且这些因子往往异因同效，故而单一因子的反义阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，只有明确神经胶质瘤发病的几种关键因子，用反义核酸同时抑制或许会取得更好的效果［8，19］。

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