抗真菌药物影响生殖细胞发育机理的研究

　 摘要 目的：探讨抗真菌药物对促性腺激素诱导的卵母细胞成熟的机理。方法：用小鼠卵母细胞体外培养模型，将小鼠卵母细胞培养在含有次黄嘌呤(HX ，卵母细胞成熟抑制物)的培养液中，观察促卵泡生成素(FSH)、两性霉素B、酮康唑对卵母 细胞减数分裂恢复的影响。结果：①FSH(10～200 IU/L)显著刺激卵丘-卵 母细胞复合体(CEO)克服HX的抑制而恢复减数分裂，该作用具有剂量依赖性(P＜0.05)； ②两性霉素B(0．0025～250 μg／L)也能够明显诱导CEO恢复减数分裂，其作用具有剂量依 赖性(P＜0.05)；③酮康唑(10-7～10-3 mol/L)剂量依赖性抑制FSH(50 IU ／L)诱导的卵母细胞减数分裂恢复(P＜0．05)，但并不影响卵母细胞的自发成熟(P ＞0．05)。结论：两性霉素B、酮康唑对卵母细胞减数分裂的恢复具有影响，其机理可能在于影响促性腺激素诱导的、卵丘细胞分泌的甾醇类物质(MAS)的产生。

　　中图分类号：　Q492.5文献标识码：A

　　文章编号：1000-6834(2000)04-0358-03

THE REGULATING MECHANISM OF ANTI-FUNGICIDES

　　ON MOUSE OOCYTE DEVELOPMENT

LU Zhong-xian　 XIA Guo-liang　 WANG Hai-bin　 CHENG Yong　 LI Mei-ling

　　（College of Biological Sciences, China Agricultural University, B eijing 100094）

　　ABSTRACT　　Aim: To study the mechanism of the effect of gonadotropin-induced o ocyte maturation.Methods:mouse oocytes were cultured in HX-medi um, and the effects of amphotericin B and ketoconazole on resumption of meiosis of mouse oocyte were examined. Results:① FSH(10～200 IU/L) indu ced a dose-dependent manner of oocytes maturation in CEO. A maximum increase in GVBD was observed with 25～50 IU/L FSH. ②Amphotericin tericim B (0.025～2.5 μ g/L)caused significant increases in GVBD in CEO, which mimicked the function of FSH.③Ketoconazole (10-7～10-3mol/L) inhibited the effect of FSH on resumption of meiosis, but no effect on oocyte spontaneous maturation. C onclution: Amphotericin B and ketoconazole are able to affect mouse oocy te maturation, and indicates that they have a regulation on FSH-induced synthes is of meiosis-activating sterol.

　　KEY WORDS:　 anti-fungicides;　mechanism;　mouse o ocyte development;　MAS

　　两性霉素、酮康唑是很有效的抗真菌感染药物，应用很广。但临床应用及动物实验发现它有 一定的副作用，特别是对生殖功能具有一定影响。超量或长期使用，可导致男子血中睾酮浓 度降低、精子减少或缺乏、乳腺发育、女子月经失调等。但这些药物影响生殖的机理，由于 缺乏进一步的研究，一直知之甚少［1］。最近一些研究发现，人卵泡液及牛睾丸组 织液中存在一种能诱导卵母细胞成熟的甾醇类物质(MAS)，可能作为一种阳性刺激因子，于 排卵前由促性腺激素诱导在卵泡中积聚，克服卵泡液中次黄嘌呤等物质的抑制，诱导卵母 细胞成熟［2～6］。两性霉素、酮康唑结构近于甾醇，其药用机理就是影响真菌甾醇 的生物合成，那么他们是否也影响促性腺激素诱导的甾醇合成。为此，本实验选用小鼠卵母 细胞的体外培养模型，旨在探讨两性霉素B、酮康唑对促卵泡生成素(FSH)诱导卵母细胞成熟 的作用的影响，以揭示抗真菌药物影响生殖功能的机理。

　　1　材料与方法

　　1．1　主要试剂

　　猪FSH(50 IU／ml)、次黄嘌呤(HX)、牛血清白蛋白v片段(BSA)、L-谷氨酰胺(Glu)、两 性霉素B为S1GMA公司产品，M199培养基、丙酮酸钠购自GIBCO公司。酮康唑为杨森制药有限 公司产品，孕马血清(PMSG)由天津实验动物研究中心提供。

　　1．2　实验动物处理

　　24～26 d昆明白小鼠，体重14～17 g，购自中国科学院遗传研究所。室温饲养，自由采 食饮水。饲养2～3 d后，腹腔注射PMSG 0．1ml／只(1×105 IU/L)。

　　1．3　卵母细胞的采集及培养

　　PMSG注射46 h后，颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，取出卵巢，放于含有4 mmol/LHX的 M199培养液(其中含有0．3％BSA，2 mmol/L Glu，0．23 mmol/L丙酮酸钠，1×105 IU/L 青、链霉素，此培养液定名为HX培养液)中，在体视显微镜下，用灭菌5号半注射针头穿刺卵 泡，释放卵丘-卵母细胞复合体(CEO)。选择包裹3～5层卵丘细胞的CEO，在38．5℃的HX培 养液中洗三次，以20～30枚／孔的密度接种于四孔培养板(丹麦Nunclon公司)内，每孔含1 m l HX培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养24 h。

　　1．4　实验处理

　　根据不同的实验设计，CEO分别在添加FSH、两性霉素B、FSH+酮康唑的HX培养液及添加 酮康唑的无HX培养液(不含HX，其余与HX培养液同)中培养24 h。培养结束后，用检卵管轻轻 吹打CEO，反复几次，吹去卵母细胞外面的卵丘细胞，观察卵母细胞的生发泡是否存在，以 生发泡破裂(GVBD)作为减数分裂恢复的标志。

　　1．5　数据处理

　　实验每个处理重复4次，结果以均值±标准差(±s)表示，用t检验进行 统计分析。

　　2　结果

　　2．1　FSH对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

　　FSH对卵母细跑的减数分裂具有明显的促进作用(图1)。CEO在加有FSH(10～200 IU/L)的 HX培养液中培养24 h，各浓度FSH组的GVBD发生率显著升高(48～61％)，均高于对照组(17％ )，其中25～50 IU/L的FSH作用最强。

Fig.1 Effect of FSH on oocyte maturation,

　　GVBD%(GVBD/total n umber of oocyte,±s,n=4).

　　*P＜0.05,vs 0; #　P＜0.05,vs 100,20 0

　　2．2　两性霉素B对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

　　两性霉素B能像FSH那样，显著提高小鼠卵母细胞减数分裂发生率。0.0025～250 μg/L浓 度的两性霉素B能够剂量依赖性促进CEO恢复减数分裂(P＜0.05)，其中0.025 μg/L的两 性霉素B可诱导42%卵母细胞发生GVBD，高于其它组(P＜0.05)；但是随着两性霉素B的浓 度升高，这种促进作用逐渐降低(图2)。

Fig.2 Effect of amphotericin B on oocyte maturation,

　　GVBD% (GVBD/total number of oocyte,±s,n=4)

　　*　P＜0.5,vs 0

　　2．3　酮康唑对小鼠卵母细胞减数分裂恢复的作用

　　酮康唑(10-7～10-3 mmol/L)剂量依赖性地抑制由FSH(50 IU/L)诱导的卵 母细胞减数分裂恢复的作用(P＜0.05，图3A)，10-5 mmol/L的酮康唑抑制作用达 到最大。但将卵母细胞培养在不加HX的培养基中培养时(自发成熟培养)，酮康唑(10-7 ～10-3 mmo/L)并不影响卵母细胞的自发成熟(P＞0.05，图3B)。

Fig.3 Effect of ketoconazole on FSH-i nduce(A) or spontancous(B)

　　oocyte maturation,GVBD%(GVBD/total number of oocyte)(±s,n=4)

　　*　P＜0.05,vs 0,10-5,10-4,10-3;#P＜0.05,vs 10-6

　　3　讨论

　　酮康唑等抗真菌药物对生殖的影响很大，但由于其症状常表现在用药的初期，往往被随后 的肝肾损伤而致死亡的症状所掩盖，不被人们重视，缺乏必要的研究。关于它们影响生殖的 机理，多根据它们导致血中睾酮、皮质醇等类固醇浓度降低等症状，推测可能通过抑制胆固 醇的合成或转化，来影响类固醇激素的合成［1,7］。但对具体的影响途径及配子产 生的直接影响，没能进一步研究。Xia和Byskov等关于促性腺激素在排卵前诱导MAS积聚，进 而诱导卵母细胞成熟的研究结果［2～7］，为抗真菌药物影响生育的机理提供了一 个新思路。抗真菌药物的抑菌机制，就是影响真菌的甾醇类物质合成，那么它也可能影响MA S的生成。本实验结果显示，0．025～2．5 μg/L浓度的两性霉素B显著促进CEO恢复减数分 裂，而10-7～10-3 mol/L的酮康唑降低FSH诱导卵母细胞成熟的作用，但不影 响卵母细胞的自发成熟。这个结果证实了上述推测，说明抗真菌药物能在两个方面调节卵丘 细跑MAS的分泌，影响卵母细胞的成熟，一是两性霉素B可能抑制MAS的进一步转化，促进MAS 的积聚；另一方面酮康唑通过抑制MAS的合成，降低FSH诱导的MAS的积聚；卵母细胞脱离抑 制物质的自发成熟，可能是内在的成熟机制所致，不需阳性刺激因子的参与，酮康唑只抑制 FSH诱导的卵母细胞成熟，而不影响卵母细胞的自发成熟，说明MAS在卵母细胞的成熟起着重 要的作用。Stromstedt(1998)等对小鼠睾丸催化MAS合成的酶P45014DM mRNA进行检测 ，发现P45014DM mRNA在整个睾丸中表达，而且在曲精细管中，特别在圆形和长形精 子细胞中表达丰富，但在Leydig细胞中仅有基础表达，因此认为MAS在精子的生成中发挥重 要的作用［8］，。这个结果从另一角度支持了本研究的结论，说明抗真菌药物抑制 配子的产生，可能主要通过影响MAS的产生而实现的，睾酮的降低可能处于次要或后续影响 。综合上述，抗真菌药物影响生殖功能，首先通过影响MAS的积聚，抑制配子的生成；长期 的作用可能通过抑制胆固醇的合成，影响类固醇的产生。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770396)

　　作者简介：吕忠显(1970-)，男，河南宁陵人，博士，从事生殖内分泌生 理学研究。

　　4　参考文献

　　［1］ 陈家伟,王　洪,郝建平,等,Cushing 综合症的酮康唑治疗［J］.中华内分泌 代谢杂志，1991，7(4)：201-203.

　　［2］ Byskov A G, Anderson C Y, Hossaini A, et al. Cumulus cells of oocyte- cumulus complexes secret a meiosis-activating substance when stimulated with FS H［J］. Mol Reprod Dev, 1997,46:296-305.

　　［3］ Xia G L, Byskov A G, Andersen C Y. Cumulus cells secret a meiosis-induci ng substance by stimulating with forskolin and dibutyril cyclic adenosine monoph osphate［J］. Mol Reprod Dev,1994;39:17-24.

　　［4］ Byskov A G, Anderson C Y, Xia G L, et al. Chemical structure of sterol s that activate oocyte meiosis［J］. Nature,1995,374:559-561.

　　［5］ Grondahl C, Ottesen J L, Lessl M, et al. Meiosis-activating sterol pr omote s resumption of meiosis in mouse oocytes cultured in vitro in contrast to relate d oxysterols［J］. Biol Reprod,1998,58:1297-1302.s

　　［6］ Andersen C Y, Batlsen M, Byskov A G. Gonadotropin-induced resumption of o ocyte meiosis and meiosis-activating sterol［J］. Curr Top Dev Biol, 1999,4 1:163-168.

　　［7］ Feidman D. Ketoconazole and other imidazole derivatives as a inhibitors of steroidogenesis［J］. Endocr Rev,1986,7:409～414.

　　［8］ Stromstedt M, Waterman M R, Haugen T B, et al. Elevated expression of lanosterol 14 α -demethylase(CYP51) and the synthesis of oocyte meiosis-activ ating sterol in postmeiotic germ cells of male rats［J］. Endocr,1998,139(5) :2314-2321.