耐力运动员及普通人群线粒体DNA调控区遗传多态性分析

　　 摘要 目的：通过PCR技术对优秀耐力项目运动员以及普通个体的mtDA调控区遗传多 态性进行分析，以期发现与运动能力相关联的基因标记。方法：以单根毛发 为检材，运用 PCR技术分析中国优秀耐力性项目运动员(n=67)，一般水平运动员(n =33)以及普通人群(n=20)的线粒体 DNA调控区(D-Loop)的 RFLP。结果：优秀耐力性 项目运动员线粒体特定区域 RFLP分布与普通人群至显著性差异。结论：一 些在优秀运动员群体中频繁出现的 D-Loop多态变异型很可能与人体有氧耐力及对耐力训练 的反应性有关。

　　中图分类号：　R87；2781文献标识码：A

　　文章 编号：1000-6834(2000)04-0327-04

ANALYSIS ON GENETIC POLYMORPHISM OF mtDNA IN

　　ENDURANCE ATHLETES AND SEDENTARY SUBJECTS

CHEN Qing　MA Li-hong　CHEN Jia-qi

　　（Tianjin Research Institute of Sports Medicine,Tianjin 300381）

　　ABSTRACT　　Aim:To analysis the sequence variation of the origin region (D-loop ) of mitochondrial DNA (mtDNA) in elite endurance athletes and sedentary subjects in order to find the genetic markers related with performance.Methods: Using a new established PCR method by virtue of tracing sample analysis, the res tricted fragment length polymorphism (RFLP) of D-loop in mtDNA was assessed in 76 elite Chinese endurance athletes (EEA),33 endurance athletes with average-le vel(GEA) and 20 sedentary control(sc).Results:There is a signifi cant difference in distribution of the polymorphism in mtDNA D-loop between the EEA and SC(χ2=33.3,P＜0.01).Conclusion:The sequence variati on of D-loop region of mtDNA in the elite endurance athletes may contribute to the individual difference in aerobic performance and trainability.

　　KEY WORDS:　aerobic performance;　mitochondrial DNA;　ge netic marker;　PCR

　　近年来，随着人类运动潜力在激烈的竞争中被最大限度的挖掘，对运动能力的遗传学研究已成为体育科学研究中的热点。然而，迄今为止的多数研究仅涉及某一特定表型的群体遗 传趋势、而对个体运动潜能的预测，或者说对基因与环境相互作用的研究较为鲜见。与普通 人群相比，耐力性项目运动员具有较高水平的有氧运动能力。许多研究证实，最大摄氧量(V O2max)，无氧阈(AT)以及赛跑节省化(RE)不仅存在较大的个体差异，而且还受基因环境 互作影响［1］。在相同环境因素(运动训练)的压力之下，相关基因的表达程度，或 者说是运动能力潜力会因人而异，从而最终在群体中呈现出高反应个体以及低反应个体。如 果能确定与此反应敏感程度相关的基因标记(genetic marker)，就可对不同个体的运动潜力 进行较为准确的预测。目前已知，基因产物一蛋白质的遗传多态现象不足以解释人体有氧运 动能力较大的个体差异，但 DNA非编码区的变异可能对基因的表达及调控有着一定程度的影 响［2］。人体有氧运动能力的发展在很大程度上依赖于能量代谢的条件。骨骼肌线 粒体生产 ATP的能力是限制有氧运动能力的主要因素之一。而人类细胞中线粒体的生成又受 核 DNA以及线粒体DNA(mtDNA)的双重控制。人类 mtDNA为母系遗传，编码2个 rRNA，22个 t RNA以及13个与呼吸链氧化磷酸化复合体有关的多肽。mtDNA也是人类细胞中唯一存在于核 D NA以外的遗传物质。其信息量虽小，却控制着线粒体一些最基本的性质。而D-Loop是 DNA 的复制原区，参与调控 mtDNA的表达。此处亦为变异多发区。Lesage［3］等人还注 意到，最大有氧运动能力的母子相关程度要大于父子相关。为此，本文通过 PCR技术对优秀 耐力项目运动员以及普通个体的 mtDNA调控区遗传多态性进行分析，以期发现与运动能力相 关联的基因标记。

　　1　材料与方法

　　1．1　受试者

　　优秀耐力性项目运动员(EEA，n=67)：国家健将级运动员(中长跑及赛艇运动员，年 龄23．9±5．74。训练年限为10～20年；男性为42名，女性为35名)。一般水平的耐力 性项日运动员(GEA，n＝33)：运动项目及训练年限与优秀组相同但成绩一般者(年龄24 ．7±4．92；男性20名，女性13名)。对照组(SC，n=20)：普通健康受试者(年龄27± 4．04；男性13名，女性7名)。

　　1．2　主要实验仪器及试剂

　　仪器：PCR扩增仪(Pecetus)；垂直板电泳仪(Biorad)：高／超速离心机(Heraeus)。

　　试剂：Chelex-100(Biao-Rad); DAN聚合酶(Pecetus);DNTP(U．S．B．)：引物(Cybersy n);限制性内切酶(Promaga)。

　　1．3　实验方法

　　实验方法依我们建立的以单根毛发为材料，结合PCR与RFLP技术的痕量检测法［4］ 。

　　取单根毛发制备模板DNA。选取引物L15926，H00580扩增mtDNA D-L00p区域。两引物相 对5'端之间碱基数为1333bp，引物序列如下：引物L15926：5’-ACTAATACACCAGTCTGTAA -ACC；引物 H00580：5’-TTGAGGAGGTAAGCTACATA。在50 μL反应体系PCR扩增mtDNA 　D-loop。酶切体系：以限制性内切酶MspI，KpnⅠ，HinfⅠ，HaeⅢ酶解mtDNA D-loop， 获得RFLP图谱。

　　1．4　质控

　　PCR最佳化控制：分别标定体系的最适Mg和Taq酶浓度；RELP质控：以相同方法 对同一个体的不同组织(毛发，唾液及血液)以及不同批次不同保存时间的样品进行重复实验 ，以确保实验结果的稳定性。双样品平行检测以避免外源DNA污染等干扰因素。

　　1．5　统计学处理

　　实验数据由 SPSS统计软件包处理。不同群体中的线粒体 DNA RFLP频率通过χ2检验(Chi-square)完成。

　　2　结果

　　表1列出三个不同群体线粒体DNA限制性片段类型分布。其中 Morph Ⅰ，Ⅱ最为常见， 其余7种出现频率较低，Morph Ⅶ，Ⅷ以及Ⅸ仅在优秀运动员组中出现。经卡方检验其分布频率呈显著性差异。图1为线粒体 DNA扩增产物经 PCR产物纯化柱纯化，获得特异的D-LOOP 区片段。图中LANE1，5为纯化前结果，2，4为纯化后结果。DNA片段大小用 bp为单位。图2 为扩增纯化后 mtDNA D-LOOP区段经4种限制性内切酶消化所得到的9种RFLP，图中 DNA片段 的大小以bp为单位。如图所示，160 bp，225 bP几乎在9种RFLP中均出现，而155 bp，123 b p较为稀有。