热应激预处理对皮瓣缺血再灌注损伤的影响及机制

www.cnkang.com 2007-1-15 11:03:00 中华康网

　【摘要】　目的　探索减轻皮瓣缺血再灌注损伤的有效措施。方法　采用大鼠腹部岛状皮瓣，制作活体原位热缺血模型，观察热缺血再灌注后皮瓣的成活率、皮瓣组织形态学改变，检测皮瓣超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、HSP70表达。结果　缺血8h后再灌注，实验组皮瓣存活率明显高于对照组；与对照组相比，实验组皮瓣组织中SOD活性较高而MDA水平较低；电镜显示，实验组皮瓣毛细血管内膜较完整，细胞肿胀轻，线粒体结构较稳定。结论　热应激预处理，能减轻缺血再灌注对皮瓣的损伤，对缺血再灌注皮瓣具有保护作用，其机制可能与热应激预处理抗自由基损害作用及维护细胞膜结构稳定有关。

Effects of heat-shock pretreatment on the survival of island flaps in rats

WU Jianming, LIN Zihao, LIU Qi, et al.

　　Department of Pla stic Surgery, Changzheng Hospital, Shanghai 200003

　　【Abstract】　Objective　This study was to develop a new method that can lessen ischemia reperfusion injury and improve the survival of the island flap.Method　A right lower abdominal island flap was created in the SD rat according to the protocol of Harashina. A nimals were divided into 2 groups (heat-shock pretreatment and control groups). The island flap viability and electronic microscopical appearance of flap tissu e were evaluated following ischemia reperfusion injury. In order to explore the mechanism of this phenomenon, we examined the contents of HSP70 and measur ed the levels of SOD and MDA of the flap at various times.Results　Compared with the control group,SOD activities of the flap were higher, and MDA content was lower. Survival rate of the island flap with heat-shock pretrea tment was significantly increased (P＜0.01).Conclusion　The heat-shock pretreatment can lessen ischemia reperfusion injury and improve the survival of the island flap. It is suggested that the mechanism be related to fo llowing aspects: ① The heat-shock pretreatment maintains stability of cell's f unction and structure. ② It may increase the ability to catabolize free radica ls by antioxidative enzymes.

　　【Key words】　Ischemia reperfusion　　Island flap　　Heat shock protein

　　热应激预处理即预先给生物及培养细胞强烈热刺激致其发生热休克反应，产生热休克蛋白(Heat shock prateins HSPs)。热休克反应是细胞水平上应激反应的一种基本形式，是生物或细胞潜在的内源性自我保护机制之一［1］。最近的研究已发现预先热应激处理大鼠能明显减轻缺血再灌注对心、肝、肾及脑组织的损伤，而热应激预处理对皮瓣组织存活及其缺血再灌注损伤的影响，迄今未见报道。我们进行初步探索旨在改善皮瓣存活，减轻皮瓣缺血再灌注损伤的研究，寻求具有潜在临床意义的新途径。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物分组　SD雌性大鼠40只，250～300g随机分实验(热应激预处理)及对照两组，每组20只。

　　1.2　热应激预处理方法　按Currie等［2］的方法，实验组动物腹腔内注射3%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，置于预先加热至50℃恒温烤箱内，使其肛温达42～42.5℃并维持15min，室温下大鼠恢复6h后制备皮瓣。

　　1.3　皮瓣制备　采用3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，脱毛后参照Manson等 ［3］的方法在鼠下腹部形成以腹壁浅血管束为蒂、大小为3cm×6cm的岛状皮瓣，皮瓣含皮下内膜层，用微血管夹阻断腹壁浅血管血流，造成皮瓣缺血。两组皮瓣分别在缺血8h之后恢复血供原位缝合，7天后观察其存活情况。

　　1.4　取材　分别在掀起皮瓣即时，缺血8h，再灌注1h及再采集标本部位为皮瓣边缘中远1/ 3处，取标本后迅速置入液氮中待测。

　　1.5　观察项目及检测指标

　　1.5.1　皮瓣存活率　1周后用坐标贴纸法测量皮瓣成活面积，方法为以经秤量纸精确地记录坏死面积。用分析天平称出秤量纸的重量。根据其重量推算出坏死面积［4］。以皮瓣设计面积与该坏死面积之差，得出皮瓣成活面积，依皮瓣成活的百分率进行统计分析 (皮瓣成活面积的百分率=皮瓣成活面积/皮瓣面积×100%)。

　　1.5.2　组织形态学观察　HE染色光镜及组织块硝酸镧染透射电镜，观察缺血8h及再灌注1 h两组皮瓣组织的形态学变化。

　　1.5.3　超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)检测　采用光还原(NBT)法测SOD活性，硫代巴比妥酸法(TBA法)计算MDA含量。

　　1.5.4　HSP70的检测　采用免疫组化中ABC法［5］，测定对照组及实验组皮瓣中HSP70。

　　1.6　统计学处理　方差分析，t检验。所有数据用(x±s)表示。

　　2　结果

　　2.1　皮瓣存活率及SOD、MDA含量测定结果分别见表1～3。

表1　缺血8h后两组皮瓣成活率(x±s)

　　Tab 1　Survival rate of the two gr oup of

　　flaps following 8h ischemia

组　别	皮瓣数	缺血时间(h)	皮瓣成活率(%)
对照组	20	8	19.21±12.04
实验组	20	8	77.69±21.39*

与对照组比较：*P＜0.01

表2　大鼠岛状皮瓣SOD活性(x±s)

　　Tab 2　Activities of SOD i n island flaps of rat

组　别	皮瓣数	缺血前	缺血8h	再灌注1h	再灌注24h
对照组	20	65.66±11.60	54.35±11.58	31.38±11. 06	20.40±8.53
实验组	20	76.87±12.98	69.83±13.09	53.80±12.67	42.64±12.41
P　值		＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01

表3　大鼠岛状皮瓣MDA值 (x±s)

　　Tab 3　Concentration of MDA in island flaps of rat

组　别	皮瓣数	缺血前	缺血8h	再灌注1h	再灌注24h
对照组	20	12.43±2.19	18.09±2.61	30.62±3.96	56.40±5.07
实验组	20	9.07±2.36	12.61±3.05	20.01±1.96	32.23±4.74
P　值		＜0.01	＜0.01	＜0.01	＜0.01

　　2.2　皮瓣组织形态学观察(图1～4)　缺血8h，对照组细胞膜连续性出现中断，有部分缺损，线粒体肿胀较重，且较早出现絮状致密沉淀斑。实验组毛细血管内皮细胞及皮瓣脂肪细胞体积明显增大，形态无明显异常，细胞膜连续性较好，线粒体轻度肿胀，嵴略不规整。再灌注1h，对照组细胞严重肿胀，膜大范围破损，有些细胞相互融合，线粒体严重膨胀，嵴少，甚至消失 (图1)，毛细血管壁肿胀，基底膜不完整，毛细血管内有大量镧染颗粒(图3)。而实验组：细胞肿胀，膜破损程度明显轻微，线粒体虽然肿胀，但较轻(图2)，毛细血管内膜基本完整，血管内仅少量镧染颗粒(图4)。

　　2.3　两组皮瓣HSP70检测　免疫组化检测示，实验组皮瓣染色阳性见大量棕褐色颗粒(图5)，对照组HSP70染色阴性(图6)。

　　3　讨论

　　游离皮瓣移植中，缺血再灌注损伤是必然遇到的问题，而缺血再灌注损伤的发生机理目前尚不完全明了。计有能量衰竭，细胞内钙超载，自由基损伤、白细胞粘附和过度活化等学说 ［6］。根据这些学说形成防治皮瓣缺血再灌注损伤的不同治疗措施，虽都取得了一定的效果，但皆不尽人意。近年来，文献报道热休克蛋白对组织器官再灌注损伤具有保护作用，我们推测通过热应激预处理产生热休克蛋白的方法，可以减轻皮瓣缺血再灌注损伤。实验结果显示，热应激预处理能提高缺血再灌注损伤皮瓣的成活率，提高缺血再灌注损伤皮瓣中的SOD活性，降低MDA水平，稳定缺血再灌注损伤皮瓣的组织细胞结构，表明热应激预处理对组织器官的缺血再灌注损害有保护作用。这一结果与Qonnely［7］对大鼠心肌及Perd rized等［8］对大鼠肾脏的研究结论一致。

　　我们对HSP70的检测显示：经热应激预处理的皮瓣组织细胞中有大量的HSP70合成，对照组则为阴性。所以认为，保护作用的环节与热应激预处理诱导皮瓣组织细胞发生热休克反应(Heat shock response，HSR)产生HSP70有关。HSR是生物体受不良环境作用时在细胞水平上产生的基因表达和调控方面变化为主的应激反应。其主要表现为：热休克蛋白的诱导和正常蛋白质合成的抑制，HSPS又称为应激蛋白(Shress proteins,SPs) ，是一切生物细胞，包括原核细胞及真核细胞，因受到增高的温度或病原体、理化因素刺激后应激产生，具有保护细胞，抗有害刺激损害作用的一类蛋白质。HSR与本实验有关的特性有：①热应激反应能为多种应激因素所诱发，除热应激外，还有缺血、缺氧、低血糖症及细胞毒性物质等。②热应激反应一经诱发，便对细胞、组织或生物体有保护作用，使之免受或少受有害因素损伤。③生物体或组织受到应激刺激后，需要度过一个绝对恢复期(通常为6～8h)。细胞先在此期间合成HSPS，其后才能耐受应激刺激。④哺乳类动物组织细胞热应激反应时主要合成HSP70。⑤最令人感兴趣的是，热应激反应的交叉保护或交叉耐受现象，即热应激预处理后，组织便产生热耐受(即热应激预处理后，细胞能耐受致死剂量的热攻击而不死亡)，同时也伴随着对其它刺激因素如缺血、缺氧或细胞毒性物质等有害刺激的耐受。反之亦然。热应激预处理能诱发组织细胞的热应激反应，提高组织细胞抗缺血、缺氧或毒物损害的能力，这一特点具有潜在的临床应用意义。

　　我们认为，HSP70对皮瓣组织细胞的保护作用，可能从下列两个途径实现：① HSP 70的分子伴侣作用［9］。皮瓣缺血、缺氧达6～8h时，组织细胞内蛋白开始出现变性，细胞内受损的蛋白肽链分子空间结构发生改变，以致丧失原有功能；而经热应激处理的大鼠，其皮瓣细胞内产生有大量的HSP70，它能使蛋白质变性的肽链重新折叠，恢复螺旋原型及其构象，同时HSP70还有助于清除已坏死的蛋白，从而维持细胞的活力。②HSP70参与了细胞内酶活性的调控，并具有细胞内抗氧化作用［10］，因而能降低缺血再灌注中氧自由基对组织细胞的损害，使得遭受损伤的皮瓣受到保护。实验证明，热应激预处理不仅能明显提高缺血再灌注皮瓣SOD的活性，而且维持活性时间延长，增强皮瓣组织清除自由基的能力；热应激预处理后实验组MDA明显降低，表明热应激预处理能减轻缺血再灌注时氧自由基对皮瓣的损伤。

　　我们采用全身加热而非局部加热方式诱发动物活体组织细胞热休克，这是因为：诱导细胞热休克所要求的温度为亚致死性温度，而局部加热方式不易控制温度，若温度过高可致皮瓣组织坏死，干扰实验结果；另外，全身加热产生热休克蛋白的量较大，在皮瓣组织中分布均匀。研究岛状皮瓣缺血再灌注损伤，采用原位热缺血模型，可避免因吻合血管造成的误差，实验稳定性好。

　　我们从启动细胞内源性自我保护机制角度出发，激发组织细胞内部抗损害的潜能，增强细胞抗氧化物损害能力，使得受缺血再灌注损伤的皮瓣受到保护，为探索保护皮瓣存活有效措施提供新的研究途径。

　　Fig 1　The mitochondria swelling and destroyed cristae, 1h after reperfusion in control group (TEM ×8000）

　　Fig 2　The mitochondria slight swelling, 1h aft er reperfusion in test group (TEM ×8000）

　　Fig 3　 A lot of particles enter capillary 48h after reperfusion in control group(TEM ×5000）

　　Fig 4　Few particles enter capil lary 48h after reperfusion in test group (TEM ×5000）

　　Fig 5　 The staining on HSP70 is positive in test group

　　Fig 6　 The staining on HSP 70 is negtive in control参考文献

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