瘢痕成纤维细胞的钙网蛋白表达研究

　　【摘要】　目的　观察钙网蛋白(CRT)在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达情况。方法　采用免疫细胞化学染色和原位ELISA技术对体外培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞进行CRT分布定位及表达水平研究。结果　瘢痕和正常皮肤成纤维细胞在处于增殖生长状态时，胞浆及核内均有不同程度的CRT表达，其中瘢痕成纤维细胞表达CRT水平(A:1.97±0.15,ELISA492nm)明显高于正常皮肤成纤维细胞水平(A:1.43±0.12),差异有非常显著意义(P＜0.01)；而在已融合的瘢痕和正常皮肤成纤维细胞内则均无CRT表达。结论　瘢痕成纤维细胞内CRT的丰富表达对促进细胞迁移、信号传递及钙存储等方面均有着积极作用。

　　Study on the expression of calreticulin in hypertrophic scar-derived fibroblasts

　　ZHAO Yede*,HE Qinglian.Department of Plastic Surgery, Navy 411 Hospital, Shanghai 200081

　　【Abstract】Objective To investigate the expression level and intracellular distribution of calreticulin(CRT) in hypertrophic scar-derived fibroblasts(HSF)and normal skin-derived fibroblasts(NSF).Methods Using anti-CRT antibody, CRT was detected in HSF and NSF by immunocytochemistry and ELISA technique.Results CRT was present in the cytoplasm and nuclei in proliferating HSF or NSF in culture, but HSF possessed significantly higher expression level of CRT than NSF(P＜0.01). When these cells (HSF and NSF) were fused , neither intracellular nor intranuclear staining for CRT was observed.Conclusion In HSF and NSF,the distribution of CRT is widespread. Because of its abundant expression in HSF, we postulate that CRT as a multifunctional protein plays an important role in Ca2+ sequestering, integrin-mediated signalling and cell adhesion.

　　【Key words】 Hypertrophic scar Fibroblast Calreticulin Expression

　　增生性瘢痕(Hypertrophic scar, HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋白(Calreticulin, CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的［1］，近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响［2-5］，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值［6］。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活性功能中的作用。

　　1　材料与方法

　　1.1　组织标本

　　增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄17～40岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间均在6～9个月之间。

　　1.2　主要试剂及物品准备

　　羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DMEM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。

　　1.3　成纤维细胞培养

　　手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。

　　1.4　CRT免疫细胞化学染色

　　体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。

　　1.5　CRT原位ELISA检测［7］

　　选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%Triton X-100 4℃作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗体(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反应。ELISA reader 上读取492nm的P值。

　　2　结果

　　2.1　成纤维细胞初代培养结果

　　在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。

　　2.2　成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果

　　原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内 CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。

　　此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。

　　2.3　成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果

　　根据CRT免疫细胞化学染色结果，我们对第5代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的CRT表达值为1.43±0.12(A)，瘢痕成纤维细胞组为1.97±0.15(A)，二组间差异有非常著性意义(P＜0.01)。

　　3　讨论

　　增生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活化即继续旺盛增殖并分泌大量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造成的一种组织病理改变，有关瘢痕成纤维细胞为何异常活化一直是整形烧伤外科领域里重点探索的课题之一。转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1和类胰岛素生长因子-1等在增生性瘢痕组织内的过度表达一直被认为是引起成纤维细胞异常活化不可忽视的因素，但越来越多实验研究表明瘢痕成纤维细胞自身生物学特性改变是触发其功能异常的关键［8］。我们通过对细胞内CRT的表达检测，进一步发现CRT不但在瘢痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明显高于正常皮肤成纤维细胞内水平。

　　CRT作为钙离子主要结合蛋白，早期研究认为CRT主要是通过影响细胞内钙离子的储存与释放而影响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的研究结果表明CRT除上述作用外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接的介导和调节作用。1997年，Zhu等人［9］通过对B16细胞CRT表达的深入研究发现实细胞内的CRT分子常常与整合素粘附分子的α链胞内区结合并成为双向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino等人［5］利用CRT缺乏而整合素表达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁移粘附研究，证实在正常培养条件下干细胞的迁移扩散能力很弱，而经转染CRT基因后，细胞的迁移粘附作用显著增强。因此，Coppolino认为细胞内CRT与整合素粘附分子直接参与细胞的信号传导、粘附、迁移扩散等生物学活性功能。Tsai等［10］曾利用体外结缔组织收缩模型发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮肤成纤维细胞更强的迁移扩散能力，并认为其作用可能与细胞内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后研究工作阶段却发现在相同培养条件下增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞除有着较强迁移扩散能力外，还具有高表达β1、α1、α2、α3及α4整合素粘附分子的特性［11］，从而提示瘢痕成纤维细胞的强迁移扩散能力与高表达整合素粘附分子有关；而从本实验对CRT在瘢痕成纤维细胞内的表达情况来看，细胞内其CRT表达并不属持续性表达，CRT的高表达期一般是在细胞的迁移扩散阶段，而当细胞融合后细胞内CRT表达甚少。但就与同一时期培养的正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕成纤维细胞内的CRT表达则显得更为丰富。因此，结合我们以往的研究工作结果，我们认为：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的CRT、整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同作用的结果，其中积聚的肌动蛋白丝是其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的CRT及整合素粘附分子则是细胞与细胞外间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、释放及其信号传导等也有着重要的意义。

　　参考文献

　　1　Krause KH, Michalak M.Calreticulin. Cell, 1997, 88:439-443.

　　2　Tector M, Zhang Q, Salter RD. Beta 2-microglobulin and calnexin can independently promote folding and disulfide bond formation in class I histocompatiblity proteins. Mol Immunol, 1997, 34:401-408.

　　3 Liu H,Bowes RC, van-de-Water B, et al. Endoplasmic reticulum chaperones GRP78 and calreticulin prevent oxidative stress, Ca2+ disturbances, and cell death in renal epithelial cells. J Biol Chem, 1997, 272:21751-21759.

　　4 Burns K, Opas M,Michalak M. Calreticulin inhibits glucocorticoid-but not cAMP-sensitive expression of tyrosine aminotransferase gene in cultrued McA-RH7777 hepatocytes. Mol Cell Biochem, 1997, 171:37-43.

　　5 Coppolino MG, Woodside MJ, Demaurex N, et al. Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion. Nature, 1997, 386:843-847.

　　6 Eggleton P, Reid KB, Kishore U, et al. Clinical relevance of calreticulin in systemic lupus erythematosus. Lupus, 1997, 6:564-571.

　　7 Winisk A, Foster C. ICAM-1 expression in a spontaneously transformed human keratinocyte cell line:Characterization by a simple cell-ELISA assay. J Invest Dermal, 1992, 99:48-52.

　　8 Tredget EE, Nedelec B, Scott-PG, et al. Hypertrophic scars, keloids, and contractures. The cellular and molecular basis for therapy. Surg Clin North Am, 1997, 77:701-30.

　　9 Zhu Q, Zelinka P, White T, et al. Calreticulin-integrin bidirectional signaling complex. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 232:354-358.

　　10 Tsai CY, Hata K, Torii S, et al. Contraction potency of hypertrophic scar-derived fibroblasts in a connective tissue model:in vitro analysis of wound contraction. Ann Plast Surg, 1995, 35:638-646.

　　11 赵烨德，何清濂，纪徐淮，等.瘢痕成纤维细胞整合素表达实验研究.第二军医大学学报，1998，19：330-332.