组特异性亲和配基在分离纯化中的应用

　　摘　要　分类介绍了常用的组特异性亲和配基在蛋白质分离纯化中的应用。讨论了亲和层析中各种组特异性亲和配基的作用特点及优缺点，介绍了亲和配基研究的一些新方向。

　　中图分类号　Q510.3

    Application of Group-specific Ligands in Affinity in Isolation and Purification

    Zhou Xubin, Xuan Hua, Li Rongxiu

　　(Shanghai Research Center of Biotechnology，Shanghai 200233)

　　生物工程产业化的一个关键技术是产品的下游加工技术，主要涉及蛋白质的分离纯化。一般来说加工成本往往占整个产品生产成本的一半以上。医用生物工程产品要求很高的纯度，因而高效的纯化方法就显得非常重要。亲和层析作为一种高效简便的分离技术，其关键因素是亲和配基的选择。亲和配基按亲和力的大小可分为两类，一类即高亲和力亲和配基(high-affinity ligands)，其KD值为10-7～10-15，如生物素、激素、抗原等。另一类即组特异性亲和配基(group-specific ligands)或一般亲和力配基(general-affinity ligands)，KD值为10-4～10-6。亲和力越高，KD值越低，如KD值远低于10-6，则生产中需要的洗脱条件就非常苛刻，如单克隆抗体。KD太高，如高于10-4，则目标分子不能停留在层析柱上，无法与杂质分开。亲和配基的最佳KD值为10-4～10-6，当KD值位于此范围时，亲和配基与蛋白质分子的作用比较适中，组特异性亲和配基由于分子较小、容量高、成本低，因而其实用性越来越受到重视。常用的组特异性亲和配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等。

　　1　天然配基

　　1.1　碳水化合物结合配基

　　自然界糖缀合物包括糖、多糖、糖脂、核苷和核苷酸、蛋白聚糖、糖蛋白、酶、抗体、受体、激素等形式，其分子中都存在碳水化合物成分。植物凝集素和硼酸盐对目标分子中碳水化合物有亲和力，因而可用于亲和纯化。如伴刀豆蛋白A，由于可与α-D-甘露糖和α-D-葡萄糖残基结合，已被成功

　　用于半乳糖转移酶同工酶、羊附睾成熟精子表面糖蛋白、牛乳糖蛋白、猪肾组织蛋白酶A等的分离。此外，麦胚凝集素可与D-N-乙酰葡糖胺结合。

　　硼酸与植物凝集素的作用机制不同，氨基苯硼酸通过芳氨基固定于相应活化的支持物上，与糖的顺式二醇形成稳定的复合物。硼酸的pKa约为9，因此，工作pH不能低于8.0～8.5，以使硼酸能保持功能性硼化物阴离子形式。脂族硼盐也已用于分离各种儿茶酚。固定的m-氨基苯硼酸盐可用于测定血清和尿中的糖基化白蛋白。此外，单糖也可用于作亲和配基，固定于环氧琼脂糖的乳糖已成功用于相思子种子中毒素和凝集素的分离［1］。

　　1.2　蛋白类配基

　　蛋白A和蛋白G分别为金黄色葡萄球菌和G群链球菌细胞壁蛋白，蛋白A和蛋白G在中性pH与免疫球蛋白牢固结合，在低pH缓冲液中解离。两种蛋白对不同来源及亚群的球蛋白结合力不同，如人IgG3对蛋白G的结合力更强，IgM对G蛋白无亲和力，与A蛋白有微弱的亲和力。蛋白A已广泛应用于高纯度抗体的制备。Schuler等［2］应用于蛋白A从杂交瘤上清中纯化出鼠IgG1单抗，Coleman等［3］报道了一种新的交联多孔疏水反应性支持物，其流通性及柱床稳定性高，可用于直接固定蛋白A。

　　调钙蛋白为一种钙依赖性蛋白，也已用于某些蛋白质的分离纯化，如重组cAMP依赖的蛋白激酶。用基因工程技术将该酶接上一调钙蛋白结合肽，作为调钙蛋白的识别及结合位点。多肽接头源自肌细胞肌球蛋白轻链激酶的C端，该亲和吸附剂同样已用于从牛脑皮质匀浆中纯化突角蛋白I和突触泡蛋白［4］。

　　2　染料配基

　　该类亲和配基可能是最具应用前景的一类组特异性亲和配基，可用于蛋白质的大规模分离纯化。常用的染料包括Cibacron Blue F3G-A、Procion Blue MX-3G或MX-R、Procion Red HE-3B、麝香草酚蓝、酚红等，这些染料配基通过模拟底物、辅助因子或结合因子与蛋白及酶的活性位点作用。最初应用的染料为固定于含羟基支持物上的商用纺织氯三嗪多磺基分子。与生物亲和吸附剂不同的是，染料配基的稳定性仅受支持物的限制。但其经济性、固定的简易性、安全性、稳定性、吸附容量等方面均优于生物配基，不足之处是选择性稍差。蓖麻毒蛋白与染料Cibacron blue 3GA的复合物的X-光衍射晶体结构表明，染料配基与目标蛋白分子的作用主要靠静电力、疏水相互作用及氢键作用(ICI，私人通讯)。因而，洗脱条件通常受可溶性竞争配基的影响。Trisacryl Plus固定的染料Cibacron blue 3GA已经用于人白蛋白的大规模分离纯化［5］，在50 L柱床上每个循环得到的白蛋白(纯度98%～100%)可达到250 g，得率约为82%。用Blue Sepharose CL-6B已从厌氧极端嗜热菌中分离出NAPD+偶联的乙醇脱氢酶。L-乳酸脱氢酶及丙酮酸激酶也已利用Cibacron blue 3GA和Procion yellow MX4G吸附剂从鼠肌肉中分离纯化出来［6］。Keruchenko等［7］用Sepharose CL6B固定的三嗪染料从酿酒酵母中纯化出高纯度的延胡索酸酶，可用于X-射线晶体学研究。固定于聚乙烯吡咯烷酮上的染料氨基酸衍生物可从蝰蛇毒素中分离出哺乳类糖蛋白神经生长因子。Herve等［8］利用Sephadex G-100、Cibacron blue F3GA从大体积人血浆中纯化α 1-酸性糖蛋白，其得率可达80%。

　　3　氨基酸类亲和配基

　　反义DNA链编码的氨基酸顺序称为反义肽。反义肽可以作为正链编码的肽或蛋白的亲和配基。通过反义肽亲和层析已分离纯化出哺乳动物细胞表达的重组人干扰素。通过计算机预测干扰素表面暴露的片段已选择出合适的反义肽片段，它们分别位于靶蛋白DNA编码区的1-14，42-54，103-115片段反义链编码片段。合成的反义肽吸附剂可十倍纯化出重组干扰素［9］。

　　针对靶酶特异识别序列的数个氨基酸、合成的多聚氨基酸以及寡聚肽已广泛应用于蛋白质分离。最成功的例子是胰酶的分离，三肽H-Gly-Ala-Arg-OH对胰酶具有高度亲和力。尿激酶原和组织纤溶酶原激活物(tPA)也可用固相合成的三肽亲和配基纯化出来。疏水基团，尤其是位于醛化精氨酸N侧的芳香族残基对tPA具有很强的亲和力，最有效的寡肽配基为过渡态类似物D-Phe-D-Phe-Argl，精氨酸为醛化精氨酸所代替，该配基可从培养基中纯化出数克tPA［10］。此外，多肽的抗体也可用做亲和配基，如环寡肽杆菌肽可用于分离纯化多种蛋白酶。多聚L-天门冬氨酸可从鼠脑中选择性去除微管相关蛋白。固定于氨已基琼脂糖上的L-组氨酸可从人胎盘中纯化1型及2型IgG。

　　4　核苷酸类配基及辅酶

　　核苷酸及核苷酸辅酶已成功用于一些酶的分离纯化。比如果糖-6-磷酸-2-激酶，果糖-2，6二磷酸酶已通过Cibacro blue琼脂糖及ATP琼脂糖柱从鼠肌肉中纯化出来。在同一核苷酸吸附剂上，Inoue等［11］从果蝇中纯化出膜相关的二酰甘油激酶。Egi等［12］利用固定化的一磷酸硫胺素从人血液中纯化出硫胺素焦磷酸激酶和腺苷酸激酶。

　　随着分子生物学和重组DNA技术的飞速发展，纯化DNA结合蛋白的方法引起了人们越来越大的兴趣。一些基于固定化DNA吸附剂的亲和层析方法得到了广泛应用，通过两个连续的纤维素固定单链DNA和双链DNA已纯化出大肠杆菌Rep蛋白。经Sepharose固定的35-mer合成寡核苷酸链，已从Hela细胞和酵母中分离出腺病毒-2晚期启动子上游元件因子。此外通过DNA-cellulose和序列特异的DNA已成功地纯化出Hpa I、Sph I、EcoR V、EcoR I等DNA限制性酶。

　　固定的肝素为一种组特异的亲和吸附剂，可用于分离纯化核苷酸/DNA结合蛋白，如限制性内切酶、因子TIF-IB，以及从牛精中分离酪蛋白激酶。

　　5　螯合金属离子

　　基于此类配基的技术称为金属螯合亲和层析(MCAC)或固相金属亲和层析(IMAC)。配基为螯合剂复合的金属离子，最常用的螯合剂为亚氨基二乙酸(IDA)，其它的还包括三(羧甲基)乙二胺、次氮基三乙酸、8-羟基喹啉等。金属离子包括Cu2＋、Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe2+等。MCAC基于特定的氨基酸(如组氨酸、色氨酸或半胱氨酸)能与固定螯合剂上金属离子的作用，该方法的选择性高，重复性好，并可用于大规模的分离纯化。对于IDA支持物，金属离子通过氮和两个羧氧原子螯合，其它的配位位点可被水或缓冲液分子占据并可被相应蛋白的功能基团所取代。改变螯合金属离子的种类可改变蛋白质和IMAC吸附剂之间的作用强度，通常Cu2+的结合能力较强，从IMAC吸附剂洗脱蛋白受pH值变化以及EDTA或竞争性物质的影响。这种亲和技术已用于微粒体细胞色素P-450同工酶的分级、血清白蛋白的吸附、缺乏组氨酰基团的多肽和蛋白作用、嗜热蓝细菌中光系统I和II的分离、固相合成的多肽的一步纯化、通过螯合多肽Lys-Gly-(His)6定向固定共价修饰单抗等。螯合的Cu2+吸附剂已成功用于分离纯化酵母表达分泌的水蛭素变体［13］。

　　6　仿生配基

　　亲和层析技术的发展引发了对亲和配基研究的深入，因而产生了许多新的配基分子，基中的仿生配基在亲和层析中的应用使得亲和层析进入了一个新的阶段。比如针对染料配基选择性较差的问题，可以通过对原有染料结构的定向改造使其类似于天然生物类配基，仿生染料对靶酶具有更好的选择性。基于对乙醇脱氢酶(ADH)和单氯三嗪染料Cibacron blue 3GA的研究，Lowe等设计了几个新的仿生染料。通过比较NAD+和Cibacron blue 3GA结合于ADH时的空间构象时发现，NAD+的腺嘌呤、腺苷核糖和焦磷酸基团在与ADH结合时与Cibacron blue 3GA的蒽醌、二氨基苯磺酸盐及三嗪基团的位置类似，然而，染料的末端氨基苯磺酸盐环与NAD+的核糖和烟酰胺基团不同。通过在染料中插入一个中间的乙基臂并将末端的O-异构体变为M-异构体，结果改造后的分子长度、灵活性及选择性都大大增强，对马肝乙醇脱氢酶的解离常数降低7倍。如果将末端的2-氨基苯磺酸盐用4-氨基苯磺酸环取代，相对应的吸附剂可一步将牛小肠碱性磷酸酶纯化330倍［14］。随着仿生染料的不断增加，商用纺织染料的选择性较差的缺陷将得到解决。

　　近年来，随着噬菌体展示技术的出现，从随机展示文库中筛选新的结合分子使得亲和配基的研究进入了一个新的阶段。噬菌体展示技术可详尽研究蛋白-蛋白作用的关键残基图谱，同时对空间构象在蛋白间相互作用的功能研究也成为可能。Koivunen等［15］通过构建一系列含有半胱氨酸残基的构象限制的多肽文库CX5C、CX6C、CX7C、CX9，分离出与整合素结合的多肽，同时确定出最佳环的大小，四种整合素主要选择性作用含-RGD-的多肽，但环的大小及RGD侧翼不同则亲和力有差别，而去除限制后，亲和力极度下降。总之，作为一种高效的分离纯化手段，亲和层析必将随着亲和配基研究技术的飞速发展而得到更广泛的应用。

参考文献

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　　3，Coleman P,Walker M,Milbrath D,et al.Immobilization of protein A at high density on azlactone-functional polymeric beads and their use in affinity chromatography.J Chromatogr,1990,458∶1～11

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　　15，Koivunen E.Wang B,Ruoslahti E.Phage libraries displaying cyclic peptides with different ring sizes:ligand specificities of the RGD-binding site on integrins.Biotechnology (NY),1995,13(3)∶265～270